人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆、表达及抗原性研究
姜政,蒲丹, 陶小红,王丕龙,重庆医科大学第一附属医院消化科重庆市 400016
黄爱龙,重庆医科大学肝炎研究所 重庆市 400010
姜政,男, 1965-06-06,四川武胜人,汉族, 1989年重庆医科大学本科毕业,1994年重庆医科大学硕士研究生毕业,现攻读2000级博士研究生,副教授, 主要从事胃肠疾病的研究.
项目负责人:姜政, 400016, 重庆市渝中区医学院路1号,重庆医科大学第一附属医院消化科. Jianggooddoctor@mailchina.com
电话:023-68891218
收稿日期:2002-11-29 接受日期:2002-12-27
Cloning,expression and antigenic analysis of heat shock protein A gene of humanHelicobacter pylori
ZhengJiang, Dan Pu, Ai-Long Huang, Xiao-Hong Tao, Pi-Long Wang
ZhengJiang, Dan Pu, Xiao-Hong Tao, Pi-Long Wang, Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing400016, China
Ai-Long Huang, Institute of Viral Hepatitis, Chongqing Medical University,Chongqing 400010, China
Correspondence to: Dr. Zheng Jiang, Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing400016, China. jianggooddoctor@mailchina.com
Received: 2002-11-29 Accepted:2002-12-27
AbstractAIM: To construct a recombinant vector containing gene encoding heatshock protein A with a Mr of 13 000 from human Helicobacter pylori (Hpylori) and express it in E. coli BL21, and to explore theantigenicity.
METHODS:The target gene was amplified from H pylori chromosome by PCR, andthen inserted into the prokaryotic expression vector pET32a (+) digestedby restrictive endonuclease enzymes of kpn I, BamH Isimultaneously. The recombinant vector was transformed and expressed in E.coli BL21.The antigenicity of recombinant fusion protein was analysed byWestern blot.
RESULTS:Enzyme digestion and sequencing analysis showed that the target gene hasbeen inserted into the recombinant vector, but as compared with the genereported by GenBank, 1.6 % of genemutation and 1.6 % of aminoacid residues change in H pylori occurred, respectively. SDS-PAGEanalysis showed that the recombinant vector could be expressed in E.coliBL21, the relative molecular mass (Mr) of expressed product was 33×103,while Mr of protein expressed by pET32a (+) was about 20×103,and soluble fusion expression product accounted for 18.96 % of totalbacterial protein. After purification with Ni+-NTA agarose resin, thepurity of recombinant fusion protein was about 95 %. Western blot resultshowed that recombinant fusion protein could be recognized by anti-Hpylori positive serum, suggesting that the protein had goodantigenicity.
CONCLUSION:The gene encoding H pylori heat shock protein A has been cloned andexpressed successfully. The results lay the foundation for development of Hpylori protein vaccine and a quick diagnostic kit for detection of Hpylori infection.
JiangZ, Pu D, Huang AL, Tao XH, Wang PL. Cloning, expression and antigenicanalysis of heat shock protein A gene of human Helicobacter pylori. ShijieHuaren Xiaohua Zazhi 2003;11(10):1480-1484
摘要
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体、进行核甘酸序列分析，并在E.coli BL21中表达，研究其抗原性，为疫苗的开发奠定基础.
方法:利用分子克隆技术从Hpylori DNA染色体中，扩增热休克蛋白A编码基因片段;将目的基因与载体pET32a(+)同时经kpnI、BamHI 双酶切、纯化、连接后，转化含有目的基因的重组载体;以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达;表达产物经纯化后，用Westernblot法检测其抗原性.
结果:经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hpylori热休克蛋白A编码基因，与GenBank报道的相比较，有1.6%的碱基(bp)发生变异，1.6%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现，融合基因表达的蛋白Mr为33×103，其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103，可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96%. 重组蛋白经Ni+-NTA琼脂糖树脂纯化后，其纯度达95%以上. 用Westernblot方法检测显示，该重组蛋白可被Hpylori阳性患者的血清所识别，具有良好的抗原性.
结论:成功地克隆并表达了Hpylori热休克蛋白A码基因，为Hpylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
姜政,蒲丹, 黄爱龙,陶小红, 王丕龙.人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆、表达及抗原性研究.世界华人消化杂志 2003;11(10):1480-1484
0 引言幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hpylori)是人类最常见的致病菌，我国普通人群的感染率为50-80%，并仍以每年1-2%的速度增加[1]，每年新增感染人数近千万.H pylori感染不但与消化性溃疡、MALT淋巴瘤、胃癌的发生有密切关系[2-7]，而且与肠道外疾病的发生也有显著的作用[8-15]，故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原[16].根除Hpylori的感染目前采取的方式很多:比如药物的二联、三联以及四联疗法，虽然可以达到治疗消化道疾病的目的，同时也不同程度的根除Hpylori的感染，但近年来，由于广泛的、大剂量的抗生素应用，导致了Hpylori耐药菌株的产生;同时出现了一些药物副作用;而且患者耐受性、依从性以及承受力都受到了挑战.鉴于此，欲求降低Hpylori感染率及其相应疾病的发生率，不少研究工作者正致力于开发研究新的Hpylori治疗以及预防方案:H pylori疫苗的开发.疫苗的研制已成为全球研究的热点，美国已将其列为21世纪疫苗优先发展的II类项目，有人预测在2010年，Hpylori疫苗将有选择地应用于人群的预防和临床治疗.新近研究表明:H pylori的尿素酶、热休克蛋白A(HspA)、中性粒细胞激活蛋白、黏附素、空泡细胞毒素、细胞毒素相关A蛋白以及Mr为18000、26 000 OMP均是有效的抗原成分[17-34].而HspA为所有的Hpylori共同的抗原成分，用作疫苗抗原可使70-80%试验小鼠获得保护，由于Hpylori属微需氧菌，培养条件高，难以获得大量天然的HspA，因此，我们采用基因克隆技术，将HspA编码基因，经PCR扩增后，构建重组载体，在E.coli中进行表达，为Hpylori疫苗的研制及快速诊断试剂盒的制备奠定基础.
1 材料和方法
1.1材料 H pylori由本校微生物学教研室提供;Top10、BL21(DE3)菌株和pET32a(+)载体，为本校病毒性肝炎研究所保存;T4 DNA连接酶和限制性内切酶(kpnI和BamHI)购自Promega公司;Taq DNA聚合酶为Takara产品;dNTP为上海生工生物工程公司产品;IPTG为sigma公司产品;PE-2400型PCR为美国PE公司产品.参照文献[33]提取Hpylori基因组DNA，取Hpylori培养物1.5mL， 以12 000r/min离心2min; 取沉淀，加入TE缓冲液567mL混悬，再加入100g/L SDS 30 mL和20g/L 蛋白酶K 3mL，于37°C温育1h;而后依次加入5mol/L NaCl 100 mL和100g/L SDS 80 mL，于65°C温育10min. 用酚及酚/氯仿各抽提3次，收集上清液转入EP管中，加入0.6倍于上清液的异丙醇，并以12000 r/min离心15s. 取沉淀，加入700mL/L乙醇1 mL洗涤，再以12000 r/min 离心5min，弃掉上清，将沉淀溶于100mLTE中，于-20 °C保存备用.
1.2 方法 热休克蛋白A(HspA)编码基因的扩增，根据GenBank，经微机分析设计扩增HspA编码基因的引物P1和p2，P1的序列为5’-CCGGTACC-ATGAAGTTTCAACCATTAGG-3’;P2为5’-CCGGATCC-GTGTTTTTTGTGATCATGAC-3’.P1引物中引入kpnI酶切位点，P2引物中引入BamHI酶切位点. 在50mL反应体系中，分别加入dNTP1 mL，DNA(作为模板)2 mL及浓度各为18mmol/L的P1和P2引物各1mL，以及TaqDNA聚合酶1 mL，按照以下条件进行PCR扩增，即94°C变性7min，然后94 °C变性1min，52 °C退火50s，72 °C延伸50s，最后1个循环结束后再72°C延伸7min，共35个循环.所获PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，同时进行10g/L琼脂糖凝胶回收.将纯化的PCR产物和载体pET32a(+)，分别以kpnI和BamHI双酶切，并用PCR纯化试剂盒进行纯化;将酶切纯化的目的基因和pET32a(+)按4:1(摩尔数)比例，并在4°C条件下连接过夜;同时根据文献[33]制备Top10感受态菌:取Top10菌的过夜培养物50mL，加于LB培养液2mL中，以 300r/min摇荡3 h，然后在室温下以10000 r/min离心 2min. 弃上清，加入100mmol/L CaCl2 150 mL混悬，置0°C冰水浴中2h，而后加入连接产物10mL混悬，依次于0°C冰水浴中30min、42 °C水浴中2min及冰水浴中2min; 加入1 mLLB培养液，于37°C孵育30min; 取200 mL培养物，涂于LB+氨苄青霉素100mg/L平皿，于37°C过夜.于次日挑选单个菌落，接种于2mL LB+氨苄青霉素100mg/L培养液中，于37°C以250r/min培养12 h.重组载体的提取，按照上海生物工程公司出版的DNA抽提纯化操作手册进行，同时进行酶切鉴定和基因测序分析.
1.2.1 重组载体pET32a(+)/HspA在E.coli中的表达 以酶切鉴定的重组载体转化E.coliBL21，随后挑选含重组载体的单个菌落接种于盛有LB培养基的试管(含氨苄青霉素100mg/L)中. 于37°C培养至A600=0.4-0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，诱导表达4h，以10 000r/min离心2min. 收集菌体，加入等体积蛋白上样缓冲液，煮沸5min，进行150g/L SDS-PAGE，筛选高表达的含重组质粒的单个菌落，以获得大量的重组蛋白.
1.2.2 表达产物的纯化及活性检测 由于融合蛋白的C端融合了6个组氨酸，故表达产物采用Ni+-NTA琼脂糖树脂进行纯化.将500 mL LB培养基制备的细菌，混悬于超声破碎液(50mmol/L NaH2PO4和300mmol/L NaCl， pH7.0)10 mL中，在35%×600 v的低温条件下，超声破碎40min，以4 °C 10 000 r/min离心15min，取上清液过Ni+-NTA琼脂糖树脂柱，先以洗涤液(50mmol/L磷酸盐缓冲液、300mmol/L NaCl及20mmol/L咪唑，pH7.8)10mL洗涤2次，然后以洗脱液(50mmol/L磷酸盐缓冲液、300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH7.8)10 mL洗脱，并分3段收集.分别取3段收集液各10mL，以等量2×蛋白上样缓冲液混匀后，煮沸5min，进行150g/L SDS-PAGE. 采集Hpylori阳性患者的血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗人血清(IgG)为二抗，以westernblot方法，检测目的蛋白的生物学活性.
2 结果
2.1 热休克蛋白A(HspA)编码基因的扩增 以Hpylori基因组DNA为模板进行PCR扩增.所获PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析(图1).结果表明，PCR扩增产物位于250-500bp之间. 序列分析证实，PCR扩增产物，即为所需要的目的基因片段，其大小约为357bp.
图1(PDF)HspA编码基因PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电脉分析.1: DNA Marker; 2: Negative control; 3: PCR products of HspA gene.
2.2 重组载体的酶切鉴定 分别以重组载体和含重组载体的Top10菌为模板，按照上述PCR扩增条件进行PCR扩增，反应体系25μL，共35个循环.所获PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，结果显示:以重组载体和含重组载体的Top10菌为模板，均能扩增出1条约为357bp的带(图2)，与实验设计相一致.说明重组载体构建成功.
图2(PDF)重组载体的PCR鉴定.1: DNA marker; 2: PCR product with the template of pET32a(+)/HspA; 3: PCRproduct with the template of Top10/pET32a(+)/HspA; 4: Negative control.
2.3HspA基因片段的序列分析 将重组载体以T7为引物进行序列分析(上海基康生物有限公司)，并采用电脑DNA分析辅助软件，对所测定的DNA序列进行同源性分析.结果发现，插入的基因片段为HspA基因的片段，其中有6个bp发生变异，另有2处编码的氨基酸残基发生变化，一处由G→D，一处由A→S，但HspA的特性无明显改变，其同源性高达98%. 关于克隆的编码HspA基因及表达的目的蛋白的序列见其后.
2.4 重组载体在E.coli中的表达 从重组载体pET32a(+)/HspA转化的E.coliBL21中，筛选高效表达菌株.将含有重组载体的单个菌落置于LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，于37°C培养至A600=0.4-0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的 IPTG诱导表达4h，以10 000r/min， 离心5min. 收集菌体，进行150g/L SDS-PAGE. 结果发现，经IPTG诱导后，可高效表达Mr为33000的融合蛋白(图3).通过Imagemastertotallab v1.11软件进行凝胶自动扫描分析，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的18.96%. 将500 mL LB(含氨苄青霉素100mg/L)培养基制备的菌体，溶于超声波缓冲液中，破碎细菌、离心以及Ni+-NTA琼脂糖树脂柱纯化，通过SDS-PAGE以及Imagemastertotallab v1.11软件进行凝胶自动扫描分析，获得纯度达95%以上的终产物.
2.5 用westernblot方法检测HspA表达产物的抗原性 将诱导培养的BL21/pET32a(+)，BL21/pET32a(+)/HspA细菌各取1mL，离心，在沉淀中加入蛋白上样缓冲液，煮沸5min，进行150g/L SDS-PAGE电泳，而后在以电压14V，4°C的条件下，进行电转8-12h，再将PVDF膜进行封闭、洗涤，加入Hpylori阳性患者的血清作为一抗，同时以HRP标记的羊抗人lgG作为二抗(1:1000)进行westernblot检测. 结果显示，在BL21/pET32a(+)/HspA的泳道上相应于其表达产物相对分子质量的地方出现了棕色的条带，而BL21/pET32a(+)的泳道上未出现任何条带(图4).
图3(PDF)重组载体在BL21中表达的全菌蛋白的150g/LSDS-PAGE分析.1,2, 6-8: Expression of recombinant vector in BL21 after induction of 4hwith IPTG; 3: Bacterial protein expressed in BL21 after induction of 4 hwith IPTG; 4: Expression of pET32a(+)in BL21; 5: Standard proteinmarker(Mr 14.2; 20.1; 24; 29; 36; 45; 66X103).
图4(PDF)用westernblot 方法检测表达产物的抗原性.1. BL21/pET32a(+); 2. BL21/pET32a(+)/HspA.
3 讨论热休克蛋白，其广泛存在于人、动物、微生物和植物细胞内，主要在细胞内发挥功能，占细胞内总蛋白的5%，属高度保守的应激蛋白质[35-38].而H pylori合成的热休克蛋白-热休克蛋白家族HspA、B，Hsp60，Hsp70等，在细菌的致病机制中起着重要的角色，同时能显著增强Hpylori尿素酶的活性.编码热休克蛋白A，B的DNA疫苗，分别接种C57BL小鼠:接种pcDNA3.1-HspA小鼠产生了IgG2a，而接种pcDNA3.1-HspB则产生IgG1/IgG2a，他们都显著地减少Hpylori在胃内的定植，同时减轻因Hpylori存在的炎症反应.因而，作者认为，以热休克蛋白为基础的(核酸DNA，或蛋白质)疫苗不失为一种有效的Hpylori疫苗.
鉴于此，我们将Hpylori HspA编码基因进行了克隆、构建了重组载体并进行了表达.克隆HspA编码基因有1.6 % (6/357)的碱基发生变异，约1.6% (2/119)的氨基酸残基发生改变，据文献[33]报道，可能的原因有:(1)所采用的Hpylori菌种不同;(2)H pylori具有转化能力，能够通过已死亡的Hpylori DNA转化而致基因组发生重排导致基因变异.(3)由Hpylori菌株间的变异引起.不同的患者感染的Hpylori具有其特殊的限制性片段长度多态性(RFLP)谱型，尤其是不同地区差别更加明显，通常有好几个片段的差异，但其高度的同源性又决定了不同菌株间编码蛋白的主要抗原决定簇的一致性，从而保证了重组载体的表达.(4)PCR扩增所致的错配现象.由于Hpylori HspA编码基因编码119个氨基酸残基，其多肽Mr约13000道尔顿，分子量较小，故我们采用原核表达载体pET32a(+)，其主要特点是，除能够编码6个组氨酸残基外，还带有大肠杆菌TrxA基因.TrxA基因可编码109个氨基酸的硫氧还蛋白，外源基因经多克隆位点插入后，可与TrxA一起融合表达.融合表达不仅提高了表达产物的稳定性，而且由于相对分子质量增大，用SDS-PAGE更容易分析鉴定.此外，外源蛋白与硫氧还蛋白之间具有肠激酶和凝血酶的识别位点，从而也方便了外源蛋白与硫氧还蛋白的分离.本研究中，我们获得了高产量的融合蛋白产物，由于载体pET32a(+)表达的6个组氨酸残基可与Ni+-NTA琼脂糖树脂中的Ni2+结合，从而可对表达产物进行纯化.我们通过Westernblotting检测了融合蛋白表达产物的抗原性，在BL21/pET32a(+)/HspA的泳道上相应于其表达产物相对分子质量的地方出现了棕色的条带，而BL21/pET32a(+)的泳道上未出现任何条带，实验结果表明，融合表达的蛋白具有良好的抗原性，能够被Hpylori阳性患者的血清所识别.为以后制备安全、高效的疫苗，以及制备ELISA快速诊断试剂盒奠定了基础.
除了构建和表达Hpylori HspA编码基因外，我们还致力于寻找活的载体.因为抗原的呈递系统影响免疫反应的质和量.黏膜免疫具有以下优点:(1)能够刺激局部免疫和体液免疫;(2)简单、经济，适合群体免疫;(3)具有广泛的场所，但到目前为止，还未找到适合人类的副作用小的活载体;而通过皮下免疫除了具有上述优点外，还具有:(1)一次性接种，终身带菌;(2)本身就是一种免疫佐剂，可增强机体免疫功能;(3)如果细菌在体内过度表达，可通过体外简单的方法加以解决，这类载体以卡介苗为代表.以 BCG(mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin)牛型结核分枝杆菌的减毒菌株作为载体，则具有无比的优越性.BCG以往主要用于预防结核菌的感染，由于是活载体及其独特的安全性和免疫佐剂作用而受到科学家们的关注，现已经研究表明，重组的BCG(rBCG)表达的IL-12、IFN-g、GM-CSF、HCG-b能被机体识别，具有生物活性，可广泛用于医疗卫生事业.关于抗爱滋病、百白破、寄生虫疫苗正在研究之中，我们正在构建以BCG为载体的重组能同时表达Hpylori HspA与Mr18 000 OMP疫苗，我们相信，不久的将来，Hpylori疫苗一定将广泛应用于临床，彻底根除与Hpylori相关的一切疾病.
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黄爱龙,重庆医科大学肝炎研究所 重庆市 400010
姜政,男, 1965-06-06,四川武胜人,汉族, 1989年重庆医科大学本科毕业,1994年重庆医科大学硕士研究生毕业,现攻读2000级博士研究生,副教授, 主要从事胃肠疾病的研究.
项目负责人:姜政, 400016, 重庆市渝中区医学院路1号,重庆医科大学第一附属医院消化科. Jianggooddoctor@mailchina.com
电话:023-68891218
收稿日期:2002-11-29 接受日期:2002-12-27
Cloning,expression and antigenic analysis of heat shock protein A gene of humanHelicobacter pylori
ZhengJiang, Dan Pu, Ai-Long Huang, Xiao-Hong Tao, Pi-Long Wang
ZhengJiang, Dan Pu, Xiao-Hong Tao, Pi-Long Wang, Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing400016, China
Ai-Long Huang, Institute of Viral Hepatitis, Chongqing Medical University,Chongqing 400010, China
Correspondence to: Dr. Zheng Jiang, Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing400016, China. jianggooddoctor@mailchina.com
Received: 2002-11-29 Accepted:2002-12-27
AbstractAIM: To construct a recombinant vector containing gene encoding heatshock protein A with a Mr of 13 000 from human Helicobacter pylori (Hpylori) and express it in E. coli BL21, and to explore theantigenicity.
METHODS:The target gene was amplified from H pylori chromosome by PCR, andthen inserted into the prokaryotic expression vector pET32a (+) digestedby restrictive endonuclease enzymes of kpn I, BamH Isimultaneously. The recombinant vector was transformed and expressed in E.coli BL21.The antigenicity of recombinant fusion protein was analysed byWestern blot.
RESULTS:Enzyme digestion and sequencing analysis showed that the target gene hasbeen inserted into the recombinant vector, but as compared with the genereported by GenBank, 1.6 % of genemutation and 1.6 % of aminoacid residues change in H pylori occurred, respectively. SDS-PAGEanalysis showed that the recombinant vector could be expressed in E.coliBL21, the relative molecular mass (Mr) of expressed product was 33×103,while Mr of protein expressed by pET32a (+) was about 20×103,and soluble fusion expression product accounted for 18.96 % of totalbacterial protein. After purification with Ni+-NTA agarose resin, thepurity of recombinant fusion protein was about 95 %. Western blot resultshowed that recombinant fusion protein could be recognized by anti-Hpylori positive serum, suggesting that the protein had goodantigenicity.
CONCLUSION:The gene encoding H pylori heat shock protein A has been cloned andexpressed successfully. The results lay the foundation for development of Hpylori protein vaccine and a quick diagnostic kit for detection of Hpylori infection.
JiangZ, Pu D, Huang AL, Tao XH, Wang PL. Cloning, expression and antigenicanalysis of heat shock protein A gene of human Helicobacter pylori. ShijieHuaren Xiaohua Zazhi 2003;11(10):1480-1484
摘要
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体、进行核甘酸序列分析，并在E.coli BL21中表达，研究其抗原性，为疫苗的开发奠定基础.
方法:利用分子克隆技术从Hpylori DNA染色体中，扩增热休克蛋白A编码基因片段;将目的基因与载体pET32a(+)同时经kpnI、BamHI 双酶切、纯化、连接后，转化含有目的基因的重组载体;以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达;表达产物经纯化后，用Westernblot法检测其抗原性.
结果:经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hpylori热休克蛋白A编码基因，与GenBank报道的相比较，有1.6%的碱基(bp)发生变异，1.6%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现，融合基因表达的蛋白Mr为33×103，其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103，可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96%. 重组蛋白经Ni+-NTA琼脂糖树脂纯化后，其纯度达95%以上. 用Westernblot方法检测显示，该重组蛋白可被Hpylori阳性患者的血清所识别，具有良好的抗原性.
结论:成功地克隆并表达了Hpylori热休克蛋白A码基因，为Hpylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
姜政,蒲丹, 黄爱龙,陶小红, 王丕龙.人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆、表达及抗原性研究.世界华人消化杂志 2003;11(10):1480-1484
0 引言幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hpylori)是人类最常见的致病菌，我国普通人群的感染率为50-80%，并仍以每年1-2%的速度增加[1]，每年新增感染人数近千万.H pylori感染不但与消化性溃疡、MALT淋巴瘤、胃癌的发生有密切关系[2-7]，而且与肠道外疾病的发生也有显著的作用[8-15]，故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原[16].根除Hpylori的感染目前采取的方式很多:比如药物的二联、三联以及四联疗法，虽然可以达到治疗消化道疾病的目的，同时也不同程度的根除Hpylori的感染，但近年来，由于广泛的、大剂量的抗生素应用，导致了Hpylori耐药菌株的产生;同时出现了一些药物副作用;而且患者耐受性、依从性以及承受力都受到了挑战.鉴于此，欲求降低Hpylori感染率及其相应疾病的发生率，不少研究工作者正致力于开发研究新的Hpylori治疗以及预防方案:H pylori疫苗的开发.疫苗的研制已成为全球研究的热点，美国已将其列为21世纪疫苗优先发展的II类项目，有人预测在2010年，Hpylori疫苗将有选择地应用于人群的预防和临床治疗.新近研究表明:H pylori的尿素酶、热休克蛋白A(HspA)、中性粒细胞激活蛋白、黏附素、空泡细胞毒素、细胞毒素相关A蛋白以及Mr为18000、26 000 OMP均是有效的抗原成分[17-34].而HspA为所有的Hpylori共同的抗原成分，用作疫苗抗原可使70-80%试验小鼠获得保护，由于Hpylori属微需氧菌，培养条件高，难以获得大量天然的HspA，因此，我们采用基因克隆技术，将HspA编码基因，经PCR扩增后，构建重组载体，在E.coli中进行表达，为Hpylori疫苗的研制及快速诊断试剂盒的制备奠定基础.
1 材料和方法
1.1材料 H pylori由本校微生物学教研室提供;Top10、BL21(DE3)菌株和pET32a(+)载体，为本校病毒性肝炎研究所保存;T4 DNA连接酶和限制性内切酶(kpnI和BamHI)购自Promega公司;Taq DNA聚合酶为Takara产品;dNTP为上海生工生物工程公司产品;IPTG为sigma公司产品;PE-2400型PCR为美国PE公司产品.参照文献[33]提取Hpylori基因组DNA，取Hpylori培养物1.5mL， 以12 000r/min离心2min; 取沉淀，加入TE缓冲液567mL混悬，再加入100g/L SDS 30 mL和20g/L 蛋白酶K 3mL，于37°C温育1h;而后依次加入5mol/L NaCl 100 mL和100g/L SDS 80 mL，于65°C温育10min. 用酚及酚/氯仿各抽提3次，收集上清液转入EP管中，加入0.6倍于上清液的异丙醇，并以12000 r/min离心15s. 取沉淀，加入700mL/L乙醇1 mL洗涤，再以12000 r/min 离心5min，弃掉上清，将沉淀溶于100mLTE中，于-20 °C保存备用.
1.2 方法 热休克蛋白A(HspA)编码基因的扩增，根据GenBank，经微机分析设计扩增HspA编码基因的引物P1和p2，P1的序列为5’-CCGGTACC-ATGAAGTTTCAACCATTAGG-3’;P2为5’-CCGGATCC-GTGTTTTTTGTGATCATGAC-3’.P1引物中引入kpnI酶切位点，P2引物中引入BamHI酶切位点. 在50mL反应体系中，分别加入dNTP1 mL，DNA(作为模板)2 mL及浓度各为18mmol/L的P1和P2引物各1mL，以及TaqDNA聚合酶1 mL，按照以下条件进行PCR扩增，即94°C变性7min，然后94 °C变性1min，52 °C退火50s，72 °C延伸50s，最后1个循环结束后再72°C延伸7min，共35个循环.所获PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，同时进行10g/L琼脂糖凝胶回收.将纯化的PCR产物和载体pET32a(+)，分别以kpnI和BamHI双酶切，并用PCR纯化试剂盒进行纯化;将酶切纯化的目的基因和pET32a(+)按4:1(摩尔数)比例，并在4°C条件下连接过夜;同时根据文献[33]制备Top10感受态菌:取Top10菌的过夜培养物50mL，加于LB培养液2mL中，以 300r/min摇荡3 h，然后在室温下以10000 r/min离心 2min. 弃上清，加入100mmol/L CaCl2 150 mL混悬，置0°C冰水浴中2h，而后加入连接产物10mL混悬，依次于0°C冰水浴中30min、42 °C水浴中2min及冰水浴中2min; 加入1 mLLB培养液，于37°C孵育30min; 取200 mL培养物，涂于LB+氨苄青霉素100mg/L平皿，于37°C过夜.于次日挑选单个菌落，接种于2mL LB+氨苄青霉素100mg/L培养液中，于37°C以250r/min培养12 h.重组载体的提取，按照上海生物工程公司出版的DNA抽提纯化操作手册进行，同时进行酶切鉴定和基因测序分析.
1.2.1 重组载体pET32a(+)/HspA在E.coli中的表达 以酶切鉴定的重组载体转化E.coliBL21，随后挑选含重组载体的单个菌落接种于盛有LB培养基的试管(含氨苄青霉素100mg/L)中. 于37°C培养至A600=0.4-0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，诱导表达4h，以10 000r/min离心2min. 收集菌体，加入等体积蛋白上样缓冲液，煮沸5min，进行150g/L SDS-PAGE，筛选高表达的含重组质粒的单个菌落，以获得大量的重组蛋白.
1.2.2 表达产物的纯化及活性检测 由于融合蛋白的C端融合了6个组氨酸，故表达产物采用Ni+-NTA琼脂糖树脂进行纯化.将500 mL LB培养基制备的细菌，混悬于超声破碎液(50mmol/L NaH2PO4和300mmol/L NaCl， pH7.0)10 mL中，在35%×600 v的低温条件下，超声破碎40min，以4 °C 10 000 r/min离心15min，取上清液过Ni+-NTA琼脂糖树脂柱，先以洗涤液(50mmol/L磷酸盐缓冲液、300mmol/L NaCl及20mmol/L咪唑，pH7.8)10mL洗涤2次，然后以洗脱液(50mmol/L磷酸盐缓冲液、300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH7.8)10 mL洗脱，并分3段收集.分别取3段收集液各10mL，以等量2×蛋白上样缓冲液混匀后，煮沸5min，进行150g/L SDS-PAGE. 采集Hpylori阳性患者的血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗人血清(IgG)为二抗，以westernblot方法，检测目的蛋白的生物学活性.
2 结果
2.1 热休克蛋白A(HspA)编码基因的扩增 以Hpylori基因组DNA为模板进行PCR扩增.所获PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析(图1).结果表明，PCR扩增产物位于250-500bp之间. 序列分析证实，PCR扩增产物，即为所需要的目的基因片段，其大小约为357bp.
图1(PDF)HspA编码基因PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电脉分析.1: DNA Marker; 2: Negative control; 3: PCR products of HspA gene.
2.2 重组载体的酶切鉴定 分别以重组载体和含重组载体的Top10菌为模板，按照上述PCR扩增条件进行PCR扩增，反应体系25μL，共35个循环.所获PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，结果显示:以重组载体和含重组载体的Top10菌为模板，均能扩增出1条约为357bp的带(图2)，与实验设计相一致.说明重组载体构建成功.
图2(PDF)重组载体的PCR鉴定.1: DNA marker; 2: PCR product with the template of pET32a(+)/HspA; 3: PCRproduct with the template of Top10/pET32a(+)/HspA; 4: Negative control.
2.3HspA基因片段的序列分析 将重组载体以T7为引物进行序列分析(上海基康生物有限公司)，并采用电脑DNA分析辅助软件，对所测定的DNA序列进行同源性分析.结果发现，插入的基因片段为HspA基因的片段，其中有6个bp发生变异，另有2处编码的氨基酸残基发生变化，一处由G→D，一处由A→S，但HspA的特性无明显改变，其同源性高达98%. 关于克隆的编码HspA基因及表达的目的蛋白的序列见其后.
2.4 重组载体在E.coli中的表达 从重组载体pET32a(+)/HspA转化的E.coliBL21中，筛选高效表达菌株.将含有重组载体的单个菌落置于LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，于37°C培养至A600=0.4-0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的 IPTG诱导表达4h，以10 000r/min， 离心5min. 收集菌体，进行150g/L SDS-PAGE. 结果发现，经IPTG诱导后，可高效表达Mr为33000的融合蛋白(图3).通过Imagemastertotallab v1.11软件进行凝胶自动扫描分析，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的18.96%. 将500 mL LB(含氨苄青霉素100mg/L)培养基制备的菌体，溶于超声波缓冲液中，破碎细菌、离心以及Ni+-NTA琼脂糖树脂柱纯化，通过SDS-PAGE以及Imagemastertotallab v1.11软件进行凝胶自动扫描分析，获得纯度达95%以上的终产物.
2.5 用westernblot方法检测HspA表达产物的抗原性 将诱导培养的BL21/pET32a(+)，BL21/pET32a(+)/HspA细菌各取1mL，离心，在沉淀中加入蛋白上样缓冲液，煮沸5min，进行150g/L SDS-PAGE电泳，而后在以电压14V，4°C的条件下，进行电转8-12h，再将PVDF膜进行封闭、洗涤，加入Hpylori阳性患者的血清作为一抗，同时以HRP标记的羊抗人lgG作为二抗(1:1000)进行westernblot检测. 结果显示，在BL21/pET32a(+)/HspA的泳道上相应于其表达产物相对分子质量的地方出现了棕色的条带，而BL21/pET32a(+)的泳道上未出现任何条带(图4).
图3(PDF)重组载体在BL21中表达的全菌蛋白的150g/LSDS-PAGE分析.1,2, 6-8: Expression of recombinant vector in BL21 after induction of 4hwith IPTG; 3: Bacterial protein expressed in BL21 after induction of 4 hwith IPTG; 4: Expression of pET32a(+)in BL21; 5: Standard proteinmarker(Mr 14.2; 20.1; 24; 29; 36; 45; 66X103).
图4(PDF)用westernblot 方法检测表达产物的抗原性.1. BL21/pET32a(+); 2. BL21/pET32a(+)/HspA.
3 讨论热休克蛋白，其广泛存在于人、动物、微生物和植物细胞内，主要在细胞内发挥功能，占细胞内总蛋白的5%，属高度保守的应激蛋白质[35-38].而H pylori合成的热休克蛋白-热休克蛋白家族HspA、B，Hsp60，Hsp70等，在细菌的致病机制中起着重要的角色，同时能显著增强Hpylori尿素酶的活性.编码热休克蛋白A，B的DNA疫苗，分别接种C57BL小鼠:接种pcDNA3.1-HspA小鼠产生了IgG2a，而接种pcDNA3.1-HspB则产生IgG1/IgG2a，他们都显著地减少Hpylori在胃内的定植，同时减轻因Hpylori存在的炎症反应.因而，作者认为，以热休克蛋白为基础的(核酸DNA，或蛋白质)疫苗不失为一种有效的Hpylori疫苗.
鉴于此，我们将Hpylori HspA编码基因进行了克隆、构建了重组载体并进行了表达.克隆HspA编码基因有1.6 % (6/357)的碱基发生变异，约1.6% (2/119)的氨基酸残基发生改变，据文献[33]报道，可能的原因有:(1)所采用的Hpylori菌种不同;(2)H pylori具有转化能力，能够通过已死亡的Hpylori DNA转化而致基因组发生重排导致基因变异.(3)由Hpylori菌株间的变异引起.不同的患者感染的Hpylori具有其特殊的限制性片段长度多态性(RFLP)谱型，尤其是不同地区差别更加明显，通常有好几个片段的差异，但其高度的同源性又决定了不同菌株间编码蛋白的主要抗原决定簇的一致性，从而保证了重组载体的表达.(4)PCR扩增所致的错配现象.由于Hpylori HspA编码基因编码119个氨基酸残基，其多肽Mr约13000道尔顿，分子量较小，故我们采用原核表达载体pET32a(+)，其主要特点是，除能够编码6个组氨酸残基外，还带有大肠杆菌TrxA基因.TrxA基因可编码109个氨基酸的硫氧还蛋白，外源基因经多克隆位点插入后，可与TrxA一起融合表达.融合表达不仅提高了表达产物的稳定性，而且由于相对分子质量增大，用SDS-PAGE更容易分析鉴定.此外，外源蛋白与硫氧还蛋白之间具有肠激酶和凝血酶的识别位点，从而也方便了外源蛋白与硫氧还蛋白的分离.本研究中，我们获得了高产量的融合蛋白产物，由于载体pET32a(+)表达的6个组氨酸残基可与Ni+-NTA琼脂糖树脂中的Ni2+结合，从而可对表达产物进行纯化.我们通过Westernblotting检测了融合蛋白表达产物的抗原性，在BL21/pET32a(+)/HspA的泳道上相应于其表达产物相对分子质量的地方出现了棕色的条带，而BL21/pET32a(+)的泳道上未出现任何条带，实验结果表明，融合表达的蛋白具有良好的抗原性，能够被Hpylori阳性患者的血清所识别.为以后制备安全、高效的疫苗，以及制备ELISA快速诊断试剂盒奠定了基础.
除了构建和表达Hpylori HspA编码基因外，我们还致力于寻找活的载体.因为抗原的呈递系统影响免疫反应的质和量.黏膜免疫具有以下优点:(1)能够刺激局部免疫和体液免疫;(2)简单、经济，适合群体免疫;(3)具有广泛的场所，但到目前为止，还未找到适合人类的副作用小的活载体;而通过皮下免疫除了具有上述优点外，还具有:(1)一次性接种，终身带菌;(2)本身就是一种免疫佐剂，可增强机体免疫功能;(3)如果细菌在体内过度表达，可通过体外简单的方法加以解决，这类载体以卡介苗为代表.以 BCG(mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin)牛型结核分枝杆菌的减毒菌株作为载体，则具有无比的优越性.BCG以往主要用于预防结核菌的感染，由于是活载体及其独特的安全性和免疫佐剂作用而受到科学家们的关注，现已经研究表明，重组的BCG(rBCG)表达的IL-12、IFN-g、GM-CSF、HCG-b能被机体识别，具有生物活性，可广泛用于医疗卫生事业.关于抗爱滋病、百白破、寄生虫疫苗正在研究之中，我们正在构建以BCG为载体的重组能同时表达Hpylori HspA与Mr18 000 OMP疫苗，我们相信，不久的将来，Hpylori疫苗一定将广泛应用于临床，彻底根除与Hpylori相关的一切疾病.
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