肝脏干细胞
展玉涛,任继萍,首都医科大学附属同仁医院消化科 北京市 100730
国家863计划资助课题,No. 2001AA216031
项目负责人:展玉涛,100730, 北京市崇内大街2号,首都医科大学附属同仁医院消化科. yutaozhan@263
收稿日期:2003-03-21 接受日期:2003-05-29
展玉涛,任继萍. 肝脏干细胞.世界华人消化杂志 2003;11(11):1735-1737
0 引言近年来干细胞研究已成为世界生命科学领域的热点并取得了较大进展，目前研究认为，不仅胚胎组织含有干细胞，而且成年器官组织中也存在干细胞，如骨髓、中枢神经系统、皮肤、胰腺、胃肠、肝脏等都具有干细胞，本文将近年来肝脏干细胞的有关研究进行综述.
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1 肝脏干细胞的概念什么是干细胞？目前尚无精确的定义，但根据功能进行干细胞定义已成共识，一般认为干细胞是指具有自我更新能力和向多种细胞分化能力的细胞[1].(1)部分肝切除1-2wk后肝脏迅速再生并能恢复到原来肝脏的大小，提示肝细胞有较强的再生能力，早期研究发现肝细胞分裂次数可达18次，而最近Overturfet al [2]应用肝细胞连续移植方法研究发现肝细胞分裂次数可高达69次，提示肝细胞具有强大的更新复制能力，因此有人认为，就功能而言肝细胞也可视为肝脏干细胞[3]，但肝细胞没有向多种细胞分化的能力，至少现在没有证实.故认为肝细胞是肝脏干细胞显然不恰当.(2)在肝脏严重损伤且残存肝细胞分裂增生受阻的情况下，肝脏中出现细胞核呈卵圆形的细胞称为卵圆细胞，已经证实，卵圆细胞能向肝细胞和胆管细胞分化[4-6]，且有资料提示，卵圆细胞也可分化为肝脏肿瘤细胞[7]，因此，有人认为卵圆细胞是肝脏的干细胞，但一般认为，卵圆细胞是位于肝脏终末胆管(Hering)管干细胞的后代，且近来研究提示，卵圆细胞来源于骨髓中的干细胞，可见卵圆细胞是干细胞的后代，卵圆细胞是肝脏的祖细胞.(3)最近，有人[8,9]认为，肝脏中含有3个层次的细胞:(1)成熟的肝细胞;(2)最初原始的决定组织特异性的干细胞，即成年肝脏Hering管细胞; (3)来源于骨髓干细胞的肝脏多潜能干细胞.除了成熟的肝细胞，肝脏还有两种起源的组织更新干细胞:胆管中的内源性干细胞和骨髓来源的外源性干细胞.根据上述资料我们认为:(1)肝细胞尽管具有强大的自我更新能力，但不是肝脏的干细胞;(2)卵圆细胞来源于肝脏干细胞，具有向肝细胞和胆管细胞分化的能力，是肝脏的祖细胞;(3)来源于血液循环并定居于肝脏的骨髓干细胞是肝脏的外源性干细胞;(4)肝脏内源性干细胞位于Hering管.
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2 肝脏内源性干细胞由于不明确肝脏干细胞特异性的标志及缺乏可靠的实验方法，因此，几十年来，对肝脏中是否存在干细胞一直存在着争议.近年来，随着基础医学科学的发展及干细胞研究的深入，尤其是证实了骨髓来源细胞能形成肝细胞，目前一般认为肝脏中存在干细胞.1866年Hering将连接肝细胞微管系统与胆树之间的腔性管道命名为Hering，透射电镜研究发现小的未分化上皮细胞衬于Hering内壁，这些细胞的胞膜一面与肝细胞相连，另一面与胆管细胞相连，并且他们共同形成围绕一个胆管样结构，多数动物模型描述的Hering管局限于门脉周围，一般认为，肝脏干细胞位于Hering管.也有人认为，肝脏干细胞位于胆管周围，胆管周围“难以形容”(nondescript)的细胞可能是干细胞[10]，但后来研究发现这种“难以形容”的胆管周围细胞不表达角蛋白和甲胎蛋白，无分化表现型和形态学改变征象，并且也未发现这些细胞在分化过程中能穿过基底膜，因此认为这些细胞不具有干细胞性质.应用传统的光学显微镜不能清楚地观察卵圆细胞的形成情况，最近Pakuet al [11]应用共聚焦显微镜及免疫组化方法研究2-氨基乙酰芴/部分肝切除模型中早期出现的卵圆细胞，发现卵圆细胞位于起源于Hering管中止于肝板末端肝细胞的基底膜内侧，在基底膜外无卵圆细胞存在，该结果支持干细胞位于Hering管的观点.此外，也有资料表明，肝脏干细胞位于胆管系统，包括终末胆管、所有胆上皮细胞及所谓的胆管内的基底细胞[12-18]，但这种观点存在着争议.
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研究证实，肝脏hering管细胞在胚胎发育期间具有二系前体能力，至少在胚胎发育的一个时期表达肝细胞和胆细胞标志，提示肝脏干细胞可能参与发育期肝细胞和胆管细胞的形成，即参与肝的发育.
成年正常肝脏肝细胞分裂处于“休眠”状态，据估计，肝细胞的更新率为1:20000-40 000，按此推算，肝脏完全更新一次约需1a，目前还未证实干细胞参与正常肝组织的更新.
成年肝脏肝组织丧失后的修复一般是由窦周细胞周围的成熟肝细胞分裂、增生完成的，如果肝损伤是广泛的和慢性的，或者肝细胞增生被抑制(如被病毒感染)，肝脏干细胞可能通过活化增生参与肝脏的修复[19].
3 肝脏外源性干细胞Petersen et al [20]采用3种相互独立的方法追踪移植骨髓细胞在肝脏中的结局:(1)将♀大鼠骨髓移植到放射致死量照射的同基因♀大鼠体内，通过PCR及荧光原位杂交法检测发现♀受体肝细胞含Y染色体;(2)将二肽酶-IV阳性的♂大鼠骨髓移植到二肽酶-IV阴性的♀大鼠体内，发现在♀大鼠肝脏内有二肽酶-IV阳性的肝细胞;(3)将细胞不表达L21-6抗原的BrownNorway大鼠肝脏移植到细胞表达L21-6抗原的Lewis大鼠体内，结果发现Lewis大鼠肝脏L21-6阳性细胞形成了胆管结构，这项研究强烈提示骨髓来源的细胞能产生肝脏细胞.Theiseet al [21]报道，在接受男性骨髓移植的女性患者肝脏中，一些肝细胞和胆管细胞表达Y染色体.类似的研究结果也在小鼠中得到了证实[22].这些研究结果提示，骨髓干细胞能移居到肝脏并分化形成肝细胞和胆管细胞[23]，具有极为重要的科学意义和潜在的临床应用价值: 一是证实了肝细胞的肝外细胞来源途径;二是表明骨髓干细胞很可能将为肝脏疾病提供新的治疗方法.因此，干细胞研究已成为肝脏病学中的研究热点.近年来，骨髓干细胞在治疗肝脏疾病方面取得了一些令人鼓舞的结果，Lagasse etal [24]选用延胡索酰已酰乙酸羟化酶基因缺陷小鼠模型，先给予致死剂量放射线照射，再给基因正常小鼠骨髓干细胞移植，移植7mo后处死小鼠，肝脏组织学检查发现，骨髓移植治疗小鼠肝脏含50-200个直径为0.5-4mm与众不同的“再生”结节，这些来源于供体细胞的“再生”结节是由形态正常且表达延胡索酰已酰乙酸羟化酶的肝细胞组成，且再生区谷氨酰胺合成酶表达方式正常，提示再生的肝小叶结构正常，肝功能检查结果表明，骨髓干细胞移植治疗的小鼠肝功能明显改善，提示骨髓干细胞可以治疗基因异常性肝脏疾病.日本学者完成了大剂量化疗药物经皮肝灌注结合自体外周血干细胞治疗晚期肝癌的一期临床实验，结果提示大剂量化疗药物经皮肝灌注结合自体外周血干细胞治疗晚期肝癌是安全的[25].肝硬化是重型地中海贫血的并发症之一，他是由铁超载引起，一般认为肝硬化是不可逆的，一项回顾性研究报道，6例重型地中海贫血并发肝硬化患者通过骨髓移植及铁去除治疗后肝硬化发生了逆转[26].
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4 肝脏干细胞的分离以前一直认为，在发育早期的肝脏中很可能存在干细胞，但由于尚未发现肝脏干细胞特异性的表面标志，因此尚未建立肝脏干细胞分离的方法，近年来随着干细胞研究的不断深入，根据干细胞表面标志特征应用流式细胞仪从发育肝脏中富集干细胞成为可能.Suzuki et al [27]从小鼠胚胎肝脏中分离了CD45+、TER119+、CD49f-CD29-、CD49f+CD29-、CD49f-CD29-及c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-细胞亚群，发现c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-细胞亚群具有较强的增生能力及形成肝克隆形成单位的能力.Suzuki et al [28]做了进一步研究，应用流式细胞仪从小鼠胚胎肝脏中分离出c-Met+CD49f+/lowc-Kit-CD45-TER119-细胞，通过体外亚克隆实验及体内实验证实上述细胞具有自我更新能力，将这种细胞移植到肝脏后能分化为肝细胞和胆管细胞，将其移植到胰腺后能分化为胰腺胆管和腺泡细胞，将其移植到十二指肠后能整合到小肠上皮中，并能分化形成小肠绒毛和隐窝，有些能分化为杯状细胞，提示分离的这些细胞也具有多分化能力.Crosby et al [29]从人肝脏中分离出CD34+或c-kit+细胞发现他们能分化为胆管上皮细胞.Avital et al [30]通过两步免疫磁珠方法从大鼠和人骨髓细胞中分离出b2m-Thy-1+细胞，发现这些细胞表达肝脏特异性基因和功能，将这种细胞经门静脉移植到大鼠肝脏中，结果这些骨髓来源的细胞能整合到肝板中并分化为成熟的肝细胞，体外培养中增加刺激肝脏再生和包含胆固醇的血清，b2m-Thy-1+细胞能分化为成熟的肝细胞并能将氨基酸代谢形成尿素，并认为这种分化依赖于胆固醇血清中尚不明确的的激素信号途径，应用电镜及三维数字重建技术证实了培养b2m-Thy-1+细胞的肝细胞超微结构.
, 百拇医药
5 肝脏干细胞研究的意义肝脏干细胞研究取得了较大进展，尤其是外源性干细胞的研究具有重要的理论意义和临床应用价值，很可能将在以下两个方面显示较好的应用前景:(1)干细胞移植治疗基因异常性肝病骨髓干细胞通过血流进入肝脏并在肝脏中能分化为肝细胞，通过将正常基因干细胞移植到基因异常肝脏中，基因正常的干细胞分化为基因正常的肝细胞，从而取代基因异常的肝细胞;(2)为生物型人工肝支持系统提供理想的肝细胞生物型人工肝支持系统是治疗急性肝功能衰竭的重要手段及进行肝移植的桥梁，目前生物型人工肝支持系统中应用的细胞为猪肝细胞，具有一定的免疫排斥反应等缺点，人骨髓干细胞向肝细胞分化的成功诱导将为生物型人工肝支持系统通过理想的肝细胞，通过从患者骨髓或外周血中提取干细胞、经体外定向分化诱导产生肝细胞，应用自体骨髓干细胞来源的肝细胞作为人工肝系统中的肝细胞能克服猪肝细胞引起的免疫排斥反应等缺陷.
无疑干细胞研究为肝病患者提供新的希望，但距临床应用干细胞治疗肝病还存在很多问题，如何获得大量高纯度的干细胞，并使这些干细胞分化为具有完全肝细胞功能的细胞.
, 百拇医药
6 参考文献1 Weissman IL, Baltimore D. Disappearing stem cells, disappearingscience. Science 2001;292:601
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28 Suzuki A, Zheng YW, Kaneko S, Onodera M, Fukao K, Nakauchi H,Taniguchi H. Clonal identification and characterization
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项目负责人:展玉涛,100730, 北京市崇内大街2号,首都医科大学附属同仁医院消化科. yutaozhan@263
收稿日期:2003-03-21 接受日期:2003-05-29
展玉涛,任继萍. 肝脏干细胞.世界华人消化杂志 2003;11(11):1735-1737
0 引言近年来干细胞研究已成为世界生命科学领域的热点并取得了较大进展，目前研究认为，不仅胚胎组织含有干细胞，而且成年器官组织中也存在干细胞，如骨髓、中枢神经系统、皮肤、胰腺、胃肠、肝脏等都具有干细胞，本文将近年来肝脏干细胞的有关研究进行综述.
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1 肝脏干细胞的概念什么是干细胞？目前尚无精确的定义，但根据功能进行干细胞定义已成共识，一般认为干细胞是指具有自我更新能力和向多种细胞分化能力的细胞[1].(1)部分肝切除1-2wk后肝脏迅速再生并能恢复到原来肝脏的大小，提示肝细胞有较强的再生能力，早期研究发现肝细胞分裂次数可达18次，而最近Overturfet al [2]应用肝细胞连续移植方法研究发现肝细胞分裂次数可高达69次，提示肝细胞具有强大的更新复制能力，因此有人认为，就功能而言肝细胞也可视为肝脏干细胞[3]，但肝细胞没有向多种细胞分化的能力，至少现在没有证实.故认为肝细胞是肝脏干细胞显然不恰当.(2)在肝脏严重损伤且残存肝细胞分裂增生受阻的情况下，肝脏中出现细胞核呈卵圆形的细胞称为卵圆细胞，已经证实，卵圆细胞能向肝细胞和胆管细胞分化[4-6]，且有资料提示，卵圆细胞也可分化为肝脏肿瘤细胞[7]，因此，有人认为卵圆细胞是肝脏的干细胞，但一般认为，卵圆细胞是位于肝脏终末胆管(Hering)管干细胞的后代，且近来研究提示，卵圆细胞来源于骨髓中的干细胞，可见卵圆细胞是干细胞的后代，卵圆细胞是肝脏的祖细胞.(3)最近，有人[8,9]认为，肝脏中含有3个层次的细胞:(1)成熟的肝细胞;(2)最初原始的决定组织特异性的干细胞，即成年肝脏Hering管细胞; (3)来源于骨髓干细胞的肝脏多潜能干细胞.除了成熟的肝细胞，肝脏还有两种起源的组织更新干细胞:胆管中的内源性干细胞和骨髓来源的外源性干细胞.根据上述资料我们认为:(1)肝细胞尽管具有强大的自我更新能力，但不是肝脏的干细胞;(2)卵圆细胞来源于肝脏干细胞，具有向肝细胞和胆管细胞分化的能力，是肝脏的祖细胞;(3)来源于血液循环并定居于肝脏的骨髓干细胞是肝脏的外源性干细胞;(4)肝脏内源性干细胞位于Hering管.
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2 肝脏内源性干细胞由于不明确肝脏干细胞特异性的标志及缺乏可靠的实验方法，因此，几十年来，对肝脏中是否存在干细胞一直存在着争议.近年来，随着基础医学科学的发展及干细胞研究的深入，尤其是证实了骨髓来源细胞能形成肝细胞，目前一般认为肝脏中存在干细胞.1866年Hering将连接肝细胞微管系统与胆树之间的腔性管道命名为Hering，透射电镜研究发现小的未分化上皮细胞衬于Hering内壁，这些细胞的胞膜一面与肝细胞相连，另一面与胆管细胞相连，并且他们共同形成围绕一个胆管样结构，多数动物模型描述的Hering管局限于门脉周围，一般认为，肝脏干细胞位于Hering管.也有人认为，肝脏干细胞位于胆管周围，胆管周围“难以形容”(nondescript)的细胞可能是干细胞[10]，但后来研究发现这种“难以形容”的胆管周围细胞不表达角蛋白和甲胎蛋白，无分化表现型和形态学改变征象，并且也未发现这些细胞在分化过程中能穿过基底膜，因此认为这些细胞不具有干细胞性质.应用传统的光学显微镜不能清楚地观察卵圆细胞的形成情况，最近Pakuet al [11]应用共聚焦显微镜及免疫组化方法研究2-氨基乙酰芴/部分肝切除模型中早期出现的卵圆细胞，发现卵圆细胞位于起源于Hering管中止于肝板末端肝细胞的基底膜内侧，在基底膜外无卵圆细胞存在，该结果支持干细胞位于Hering管的观点.此外，也有资料表明，肝脏干细胞位于胆管系统，包括终末胆管、所有胆上皮细胞及所谓的胆管内的基底细胞[12-18]，但这种观点存在着争议.
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研究证实，肝脏hering管细胞在胚胎发育期间具有二系前体能力，至少在胚胎发育的一个时期表达肝细胞和胆细胞标志，提示肝脏干细胞可能参与发育期肝细胞和胆管细胞的形成，即参与肝的发育.
成年正常肝脏肝细胞分裂处于“休眠”状态，据估计，肝细胞的更新率为1:20000-40 000，按此推算，肝脏完全更新一次约需1a，目前还未证实干细胞参与正常肝组织的更新.
成年肝脏肝组织丧失后的修复一般是由窦周细胞周围的成熟肝细胞分裂、增生完成的，如果肝损伤是广泛的和慢性的，或者肝细胞增生被抑制(如被病毒感染)，肝脏干细胞可能通过活化增生参与肝脏的修复[19].
3 肝脏外源性干细胞Petersen et al [20]采用3种相互独立的方法追踪移植骨髓细胞在肝脏中的结局:(1)将♀大鼠骨髓移植到放射致死量照射的同基因♀大鼠体内，通过PCR及荧光原位杂交法检测发现♀受体肝细胞含Y染色体;(2)将二肽酶-IV阳性的♂大鼠骨髓移植到二肽酶-IV阴性的♀大鼠体内，发现在♀大鼠肝脏内有二肽酶-IV阳性的肝细胞;(3)将细胞不表达L21-6抗原的BrownNorway大鼠肝脏移植到细胞表达L21-6抗原的Lewis大鼠体内，结果发现Lewis大鼠肝脏L21-6阳性细胞形成了胆管结构，这项研究强烈提示骨髓来源的细胞能产生肝脏细胞.Theiseet al [21]报道，在接受男性骨髓移植的女性患者肝脏中，一些肝细胞和胆管细胞表达Y染色体.类似的研究结果也在小鼠中得到了证实[22].这些研究结果提示，骨髓干细胞能移居到肝脏并分化形成肝细胞和胆管细胞[23]，具有极为重要的科学意义和潜在的临床应用价值: 一是证实了肝细胞的肝外细胞来源途径;二是表明骨髓干细胞很可能将为肝脏疾病提供新的治疗方法.因此，干细胞研究已成为肝脏病学中的研究热点.近年来，骨髓干细胞在治疗肝脏疾病方面取得了一些令人鼓舞的结果，Lagasse etal [24]选用延胡索酰已酰乙酸羟化酶基因缺陷小鼠模型，先给予致死剂量放射线照射，再给基因正常小鼠骨髓干细胞移植，移植7mo后处死小鼠，肝脏组织学检查发现，骨髓移植治疗小鼠肝脏含50-200个直径为0.5-4mm与众不同的“再生”结节，这些来源于供体细胞的“再生”结节是由形态正常且表达延胡索酰已酰乙酸羟化酶的肝细胞组成，且再生区谷氨酰胺合成酶表达方式正常，提示再生的肝小叶结构正常，肝功能检查结果表明，骨髓干细胞移植治疗的小鼠肝功能明显改善，提示骨髓干细胞可以治疗基因异常性肝脏疾病.日本学者完成了大剂量化疗药物经皮肝灌注结合自体外周血干细胞治疗晚期肝癌的一期临床实验，结果提示大剂量化疗药物经皮肝灌注结合自体外周血干细胞治疗晚期肝癌是安全的[25].肝硬化是重型地中海贫血的并发症之一，他是由铁超载引起，一般认为肝硬化是不可逆的，一项回顾性研究报道，6例重型地中海贫血并发肝硬化患者通过骨髓移植及铁去除治疗后肝硬化发生了逆转[26].
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4 肝脏干细胞的分离以前一直认为，在发育早期的肝脏中很可能存在干细胞，但由于尚未发现肝脏干细胞特异性的表面标志，因此尚未建立肝脏干细胞分离的方法，近年来随着干细胞研究的不断深入，根据干细胞表面标志特征应用流式细胞仪从发育肝脏中富集干细胞成为可能.Suzuki et al [27]从小鼠胚胎肝脏中分离了CD45+、TER119+、CD49f-CD29-、CD49f+CD29-、CD49f-CD29-及c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-细胞亚群，发现c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-细胞亚群具有较强的增生能力及形成肝克隆形成单位的能力.Suzuki et al [28]做了进一步研究，应用流式细胞仪从小鼠胚胎肝脏中分离出c-Met+CD49f+/lowc-Kit-CD45-TER119-细胞，通过体外亚克隆实验及体内实验证实上述细胞具有自我更新能力，将这种细胞移植到肝脏后能分化为肝细胞和胆管细胞，将其移植到胰腺后能分化为胰腺胆管和腺泡细胞，将其移植到十二指肠后能整合到小肠上皮中，并能分化形成小肠绒毛和隐窝，有些能分化为杯状细胞，提示分离的这些细胞也具有多分化能力.Crosby et al [29]从人肝脏中分离出CD34+或c-kit+细胞发现他们能分化为胆管上皮细胞.Avital et al [30]通过两步免疫磁珠方法从大鼠和人骨髓细胞中分离出b2m-Thy-1+细胞，发现这些细胞表达肝脏特异性基因和功能，将这种细胞经门静脉移植到大鼠肝脏中，结果这些骨髓来源的细胞能整合到肝板中并分化为成熟的肝细胞，体外培养中增加刺激肝脏再生和包含胆固醇的血清，b2m-Thy-1+细胞能分化为成熟的肝细胞并能将氨基酸代谢形成尿素，并认为这种分化依赖于胆固醇血清中尚不明确的的激素信号途径，应用电镜及三维数字重建技术证实了培养b2m-Thy-1+细胞的肝细胞超微结构.
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5 肝脏干细胞研究的意义肝脏干细胞研究取得了较大进展，尤其是外源性干细胞的研究具有重要的理论意义和临床应用价值，很可能将在以下两个方面显示较好的应用前景:(1)干细胞移植治疗基因异常性肝病骨髓干细胞通过血流进入肝脏并在肝脏中能分化为肝细胞，通过将正常基因干细胞移植到基因异常肝脏中，基因正常的干细胞分化为基因正常的肝细胞，从而取代基因异常的肝细胞;(2)为生物型人工肝支持系统提供理想的肝细胞生物型人工肝支持系统是治疗急性肝功能衰竭的重要手段及进行肝移植的桥梁，目前生物型人工肝支持系统中应用的细胞为猪肝细胞，具有一定的免疫排斥反应等缺点，人骨髓干细胞向肝细胞分化的成功诱导将为生物型人工肝支持系统通过理想的肝细胞，通过从患者骨髓或外周血中提取干细胞、经体外定向分化诱导产生肝细胞，应用自体骨髓干细胞来源的肝细胞作为人工肝系统中的肝细胞能克服猪肝细胞引起的免疫排斥反应等缺陷.
无疑干细胞研究为肝病患者提供新的希望，但距临床应用干细胞治疗肝病还存在很多问题，如何获得大量高纯度的干细胞，并使这些干细胞分化为具有完全肝细胞功能的细胞.
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