直肠癌药敏检测102例
魏寿江,王崇树, 赵国刚,侯华芳,川北医学院附属医院普外科 四川省南充市 637000
四川省卫生厅基金资助课题,No. 川卫科教发2001(41)
项目负责人:王崇树,637000, 四川省南充市文化路113号,川北医学院附属医院普外科.
电话:0817-2262082 传真:0817-2262124
收稿日期:2003-03-07 接受日期:2003-03-26
摘要
目的:通过对直 肠癌细胞化疗药物敏感性检测，探讨直肠癌对不同抗癌药物以及不同方案联合药物的敏感性差异，以期对直肠癌围手术期辅助化疗及晚期患者化疗起指导作用.
, 百拇医药
方法:用MTT法对102例新鲜人直肠癌标本进行化疗药物敏感性检测.
结果:对本组直肠癌敏感的化疗药物依次为:MMC、HCPT、5-FU等，敏感性好的化疗方案依次为:HCPT+MMC、5-FU+MMC、5-FU+HCPT、CDDP+MMC等，显示出不同个体对抗癌药物敏感性不同，联合化疗药物其敏感性明显高于单药.
结论:结果表明，体外肿瘤细胞药敏实验对临床肿瘤化疗用药有一定的预见性，针对不同个体组合高效、合理的化疗方案，从而提高临床肿瘤的化疗疗效.
魏寿江,王崇树, 赵国刚,侯华芳. 直肠癌药敏检测102例.世界华人消化杂志 2003;11(11):1812-1814
, 百拇医药
0 引言肿瘤细胞体外培养及药敏实验即MTT法实验，Mosmann[1]创建之初用于细胞毒试验检测，目前该法已扩展应用于体外抗癌药物敏感实验以及抗癌新药筛选[2-5]，在指导临床肿瘤患者进行量体裁衣式的化疗方面，取得了一定的临床效果，获得了肿瘤学界的肯定.我们采用MTT法对我科2001-01/2002-12间收治的经手术及病理确诊的102例直肠癌患者的肿瘤标本进行体外敏感性检测，以探讨其内在化疗用药规律，现将结果报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 本组102例直肠癌(所有病例术前均未使用抗癌药物)，其中男57例，女45例，年龄20-77岁，中位年龄52岁.病理学类型:分化型腺癌81例，黏液性腺癌10例，管状腺癌7例，小细胞癌3例，腺鳞癌1例.实验仪器及设备:(1)CO2细胞培养箱(formasicentific); (2)倒置荧光相差显微镜(Olympus);(3)自动酶标仪(上海318-MicroplateReader); (4)超净工作台(苏州安泰，SW-CJ-2FD);(5)恒温水浴箱(江苏太仓，HWS-20);(6)微量振荡器(上海精科MM-1);(7)低速离心机(北京医用离心机厂，LDZ5-2);(8)96孔细胞培养板.实验药物及试剂:(1)10 %小牛血清(杭州四季青);(2)MTT(FLUKA); (3)二甲亚砜(DMSO);(4)RPMI-1640(GIBCO); (5)抗癌药物:5-氟脲嘧啶(5-FU)、丝裂酶素(MMC)、羟基喜树碱(HCPT)、阿霉素(ADM)、顺铂(CDDP).
, 百拇医药
1.2 方法 (1)首先制备肿瘤单细胞悬液[6-8]:术中切除直肠癌后，自直肠癌生长良好处取约3cm肿瘤组织，放入含有青链霉素的双抗液中，常规修剪去除肿瘤组织周围的坏死及非肿瘤组织，剪碎肿瘤组织并用200目不锈钢滤网制成肿瘤单细胞悬液，以1000 rpm/min离心10min后弃上清夜(以下同)，用含100mL/L小牛血清的RPMI-1640液调整细胞浓度为5×104-5× 105个细胞/mL，种植于无菌96孔培养板上，每孔体积为200mL;(2)大肠癌细胞药敏试验 在上述96孔培养板中，实验设试剂对照(8个平行孔)，肿瘤细胞阴性对照(8个平行孔)，各种抗癌药物试验组(每种药物有3个平行孔)，每孔加药量为20mL，终浓度为各抗癌药物血峰浓度的1/10.将培养板置于37°C，100mL/L CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养68h，取出离心后弃上清夜，每孔加入不完全培养液200mL，MTT(5 mg/mL) 20 mL，继续培养4h，取出再离心弃上清液，每孔加DMSO200mL，微量振荡器振荡5min，在578 nm波长自动酶标仪上进行比色、读数，测出每孔吸光度值(A).判断标准[6，9]:药物对肿瘤细胞抑制率=[1-(药物孔平均A值/肿瘤细胞阴性对照孔平均A值)]×100%
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肿瘤细胞抑制率:大于70 %为敏感，50-70%为中度敏感，小于50%为不敏感; 中度敏感和敏感归为阳性，不敏感归为阴性，敏感率(%)则为阳性病例与该组总病例相除的百分率.
统计学处理 采用SAS统计软件对本组计数资料行x2检验.
2 结果敏感试验见表1单药组间比较，x2=40.23，P =0.001，组间有显著差异;联合用药组间比较，x2=82.9，P=0.001， 组间有显著差异;单用5-FU与所有联合5-FU用药组间比较，x2=61.75，P=0.001，组间有显著差异;单用HCPT和联合HCPT用药组间比较，x2=42.89，P=0.001， 组间有显著差异;单用MMC和联合MMC用药组间比较，x2=5.911，P=0.116， 组间无显著差异;单用CDDP和联合CDDP用药组间比较，x2=27.65，P=0.01，组间有显著差异;单用ADM和联合ADM用药组间比较，x2=6.54，P =0.038，组间有差异.
, 百拇医药
表1 102例直肠癌对抗癌药物的敏感试验结果
, 百拇医药
3 讨论直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其治疗原则是以手术为主的综合治疗，一般要根据具体情况而定[10]，化疗则是直肠癌多学科综合治疗的一个重要组成部分，合理的化疗有助于改善直肠癌患者的疗效和提高生存率.辅助化疗不但可以起到减灭微小转移灶的作用，而且能起到增加放射治疗敏感性的作用[11].近年，肿瘤耐药性的研究已成为热点，有文献报道人大肠癌作为mdr1/P-GP高表达肿瘤之一，表达率在38-96%之间[12].由于直肠癌存在先天性耐药，且有明显的个体差异，表明开展肿瘤体外药敏试验(MTT法)针对不同个体筛选敏感药物、提高临床疗效是十分必要的.Von Hoff [13]报告肿瘤体外药敏试验结果与体内疗效的符合率为84.7%，阳性结果符合率为92.2%，阴性结果符合率为69.1%; Tomita et al [14]研究表明，体外药敏试验与体内临床用药不敏感(阴性结果)相符合率均为90%. 由此表明，不论是真阳性及真阴性符合率，应用具有简便、快速、敏感、结果可靠等优点的MTT法试验，对于制定临床肿瘤合理化疗策略具有指导意义.
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课题组采用MTT法结合近年临床消化道肿瘤常用的5种抗癌药物以及这5种抗癌药物的各种组合方案，对我院近年收治的大肠癌实施肿瘤细胞体外药敏筛选，其结果显示:无论是单药组还是联合用药组，组间差异均有显著统计学意义(P<0.01)[15]，表明大肠肿瘤对化疗药物的敏感性差异较大.本文通过对102例直肠癌患者实施药敏筛选以及优化组合化疗方案，这在国内外文献中鲜有报道. 结果显示:单药组组间差异有显著统计学意义，直肠癌单一用药以MMC和HCPT最为敏感，敏感率分别为73.53%、49.02 %，而CDDP和ADM的敏感率较低，分别为36.28%、35.29 %，表明直肠癌对单一用药敏感性的差异较大，这可能与肿瘤先天存在多药耐药性的个体差异有关;联合用药组组间差异有统计学意义，直肠癌联合用药则以HCPT+MMC和5-FU+MMC最为敏感，敏感率分别为84.31%、82.35 %，而5-FU+CDDP和5-FU+ADM的敏感率较低，分别为46.08%、47.06 %，表明直肠癌对联合用药的敏感性也存在明显差异，这可能与组合的单药充分发挥各自对肿瘤细胞不同的作用靶点优势、克服肿瘤的先天性耐药有关;单药组和联合用药组组间差异有显著统计学意义，联合用药组敏感性明显优于单药组敏感性，表明直肠癌患者化疗应选择联合用药的方案;MMC单用与MMC为主的联合用药敏感性无明显差异，在本组直肠癌中都体现出了较好的敏感性，对于制定直肠癌患者化疗方案具有指导作用;此外，常用化疗药物ADM、CDDP以及其分别与5-FU联合用药的敏感性在本组结果中均较低，这应引起临床消化道肿瘤医师的重视.
, 百拇医药
本组直肠癌患者根据肿瘤细胞体外药敏实验结果选择敏感性好的化疗药物和化疗方案进行治疗，其远期疗效值得随访研究;化疗药物的敏感性与直肠癌多药耐药性、患者性别、年龄、直肠癌分期以及病理学类型等诸多问题的相关性，也有待进一步探讨.
4 参考文献1 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvival: application to proliferation and cytotoxicity
assays. J Immun1ol Meth 1983;65:55-63
2 Sargent JM, Taylor CG. Appraisal of the MTT assay as a rapid testof chemosenstivity in acute myeloid leukaemia. Br
, 百拇医药
J Cancer 1989;60:206-210
3 Bellamy WT. Prediction of response to drug therapy of cancer: areview of in vitro assays. Drug 1992;44:690-708
4 曾庆华,吕新生, 汤辉焕.MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.中国普通外科杂志 2000;9:552-554
5 黄海茵,郭映华, 于尔辛.体外细胞培养应用于中药复方研究的进展.中国中西医结合杂志 2000;20:394-396
6 汤为学,骆云鹏, 王瑞雪.人实体瘤抗癌药物敏感试验MTT法的建立.重庆医科大学学报 1992;17:103-108
, http://www.100md.com
7 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京: 北京出版社, 1994:133-135
8 张亚历,周殿元, 万田谟,张月彩. 大肠癌个体化疗药敏试验的组织取材及培养方法的探讨.中国肛肠病杂志 1995;15:3-5
9 韩锐.肿瘤化学预防及药物治疗.第2版.北京: 北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社出版, 1991:420-421
10 晏仲舒.大肠癌辅助化疗.中国普通外科杂志 2001;11:641-642
11 钱俊,楼荣灿. 大肠癌辅助化疗进展.国外医学肿瘤学分册 1999; 26:118-120
12 刘冀龙,董新舒, 刘忠臣,田野. 应用RT-PCR方法定量分析大肠癌患者多药耐药基因表达水平及其临床意义.中国肿瘤
, 百拇医药
临床 1999;26:39-41
13 Von Hoff DD. In vitro predictive testing: the sulfonamide era. IntJ Cell Cloning 1987;5:179-190
14 Tomita K, Shimozaki E, Tsuchiya H. Improvement of human tumorclonogenic assay using cell culture in soft part
sarcoma of the extremity. Nippon Gan ChiryoGakkai Shi 1989;24:83-93
15 魏寿江,赵国刚, 王崇树,侯华芳. 大肠癌化疗药敏检测及临床意义.四川医学 2002;23:1243-1244, 百拇医药( 魏寿江, 王崇树, 赵国刚, 侯华芳)
四川省卫生厅基金资助课题,No. 川卫科教发2001(41)
项目负责人:王崇树,637000, 四川省南充市文化路113号,川北医学院附属医院普外科.
电话:0817-2262082 传真:0817-2262124
收稿日期:2003-03-07 接受日期:2003-03-26
摘要
目的:通过对直 肠癌细胞化疗药物敏感性检测，探讨直肠癌对不同抗癌药物以及不同方案联合药物的敏感性差异，以期对直肠癌围手术期辅助化疗及晚期患者化疗起指导作用.
, 百拇医药
方法:用MTT法对102例新鲜人直肠癌标本进行化疗药物敏感性检测.
结果:对本组直肠癌敏感的化疗药物依次为:MMC、HCPT、5-FU等，敏感性好的化疗方案依次为:HCPT+MMC、5-FU+MMC、5-FU+HCPT、CDDP+MMC等，显示出不同个体对抗癌药物敏感性不同，联合化疗药物其敏感性明显高于单药.
结论:结果表明，体外肿瘤细胞药敏实验对临床肿瘤化疗用药有一定的预见性，针对不同个体组合高效、合理的化疗方案，从而提高临床肿瘤的化疗疗效.
魏寿江,王崇树, 赵国刚,侯华芳. 直肠癌药敏检测102例.世界华人消化杂志 2003;11(11):1812-1814
, 百拇医药
0 引言肿瘤细胞体外培养及药敏实验即MTT法实验，Mosmann[1]创建之初用于细胞毒试验检测，目前该法已扩展应用于体外抗癌药物敏感实验以及抗癌新药筛选[2-5]，在指导临床肿瘤患者进行量体裁衣式的化疗方面，取得了一定的临床效果，获得了肿瘤学界的肯定.我们采用MTT法对我科2001-01/2002-12间收治的经手术及病理确诊的102例直肠癌患者的肿瘤标本进行体外敏感性检测，以探讨其内在化疗用药规律，现将结果报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 本组102例直肠癌(所有病例术前均未使用抗癌药物)，其中男57例，女45例，年龄20-77岁，中位年龄52岁.病理学类型:分化型腺癌81例，黏液性腺癌10例，管状腺癌7例，小细胞癌3例，腺鳞癌1例.实验仪器及设备:(1)CO2细胞培养箱(formasicentific); (2)倒置荧光相差显微镜(Olympus);(3)自动酶标仪(上海318-MicroplateReader); (4)超净工作台(苏州安泰，SW-CJ-2FD);(5)恒温水浴箱(江苏太仓，HWS-20);(6)微量振荡器(上海精科MM-1);(7)低速离心机(北京医用离心机厂，LDZ5-2);(8)96孔细胞培养板.实验药物及试剂:(1)10 %小牛血清(杭州四季青);(2)MTT(FLUKA); (3)二甲亚砜(DMSO);(4)RPMI-1640(GIBCO); (5)抗癌药物:5-氟脲嘧啶(5-FU)、丝裂酶素(MMC)、羟基喜树碱(HCPT)、阿霉素(ADM)、顺铂(CDDP).
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1.2 方法 (1)首先制备肿瘤单细胞悬液[6-8]:术中切除直肠癌后，自直肠癌生长良好处取约3cm肿瘤组织，放入含有青链霉素的双抗液中，常规修剪去除肿瘤组织周围的坏死及非肿瘤组织，剪碎肿瘤组织并用200目不锈钢滤网制成肿瘤单细胞悬液，以1000 rpm/min离心10min后弃上清夜(以下同)，用含100mL/L小牛血清的RPMI-1640液调整细胞浓度为5×104-5× 105个细胞/mL，种植于无菌96孔培养板上，每孔体积为200mL;(2)大肠癌细胞药敏试验 在上述96孔培养板中，实验设试剂对照(8个平行孔)，肿瘤细胞阴性对照(8个平行孔)，各种抗癌药物试验组(每种药物有3个平行孔)，每孔加药量为20mL，终浓度为各抗癌药物血峰浓度的1/10.将培养板置于37°C，100mL/L CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养68h，取出离心后弃上清夜，每孔加入不完全培养液200mL，MTT(5 mg/mL) 20 mL，继续培养4h，取出再离心弃上清液，每孔加DMSO200mL，微量振荡器振荡5min，在578 nm波长自动酶标仪上进行比色、读数，测出每孔吸光度值(A).判断标准[6，9]:药物对肿瘤细胞抑制率=[1-(药物孔平均A值/肿瘤细胞阴性对照孔平均A值)]×100%
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肿瘤细胞抑制率:大于70 %为敏感，50-70%为中度敏感，小于50%为不敏感; 中度敏感和敏感归为阳性，不敏感归为阴性，敏感率(%)则为阳性病例与该组总病例相除的百分率.
统计学处理 采用SAS统计软件对本组计数资料行x2检验.
2 结果敏感试验见表1单药组间比较，x2=40.23，P =0.001，组间有显著差异;联合用药组间比较，x2=82.9，P=0.001， 组间有显著差异;单用5-FU与所有联合5-FU用药组间比较，x2=61.75，P=0.001，组间有显著差异;单用HCPT和联合HCPT用药组间比较，x2=42.89，P=0.001， 组间有显著差异;单用MMC和联合MMC用药组间比较，x2=5.911，P=0.116， 组间无显著差异;单用CDDP和联合CDDP用药组间比较，x2=27.65，P=0.01，组间有显著差异;单用ADM和联合ADM用药组间比较，x2=6.54，P =0.038，组间有差异.
, 百拇医药
表1 102例直肠癌对抗癌药物的敏感试验结果
| 测试药物 | 阳性(n) | 阴性(n) | 敏感率(%) |
| 5-FU | 43 | 59 | 42.16 |
| HCPT | 50 | 52 | 49.02 |
| MMC | 75 | 27 | 73.53 |
| CDDP | 37 | 65 | 36.28 |
| ADM | 36 | 66 | 35.29 |
| 5-FU+HCPT | 78 | 24 | 76.47 |
| 5-FU+MMC | 84 | 18 | 82.35 |
| 5-FU+CDDP | 47 | 55 | 46.08 |
| 5-FU+ADM | 48 | 56 | 47.06 |
| HCPT+MMC | 86 | 16 | 84.31 |
| CDDP+HCPT | 73 | 29 | 71.57 |
| HCPT+ADM | 54 | 48 | 52.94 |
| CDDP+MMC | 75 | 27 | 73.53 |
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3 讨论直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其治疗原则是以手术为主的综合治疗，一般要根据具体情况而定[10]，化疗则是直肠癌多学科综合治疗的一个重要组成部分，合理的化疗有助于改善直肠癌患者的疗效和提高生存率.辅助化疗不但可以起到减灭微小转移灶的作用，而且能起到增加放射治疗敏感性的作用[11].近年，肿瘤耐药性的研究已成为热点，有文献报道人大肠癌作为mdr1/P-GP高表达肿瘤之一，表达率在38-96%之间[12].由于直肠癌存在先天性耐药，且有明显的个体差异，表明开展肿瘤体外药敏试验(MTT法)针对不同个体筛选敏感药物、提高临床疗效是十分必要的.Von Hoff [13]报告肿瘤体外药敏试验结果与体内疗效的符合率为84.7%，阳性结果符合率为92.2%，阴性结果符合率为69.1%; Tomita et al [14]研究表明，体外药敏试验与体内临床用药不敏感(阴性结果)相符合率均为90%. 由此表明，不论是真阳性及真阴性符合率，应用具有简便、快速、敏感、结果可靠等优点的MTT法试验，对于制定临床肿瘤合理化疗策略具有指导意义.
, http://www.100md.com
课题组采用MTT法结合近年临床消化道肿瘤常用的5种抗癌药物以及这5种抗癌药物的各种组合方案，对我院近年收治的大肠癌实施肿瘤细胞体外药敏筛选，其结果显示:无论是单药组还是联合用药组，组间差异均有显著统计学意义(P<0.01)[15]，表明大肠肿瘤对化疗药物的敏感性差异较大.本文通过对102例直肠癌患者实施药敏筛选以及优化组合化疗方案，这在国内外文献中鲜有报道. 结果显示:单药组组间差异有显著统计学意义，直肠癌单一用药以MMC和HCPT最为敏感，敏感率分别为73.53%、49.02 %，而CDDP和ADM的敏感率较低，分别为36.28%、35.29 %，表明直肠癌对单一用药敏感性的差异较大，这可能与肿瘤先天存在多药耐药性的个体差异有关;联合用药组组间差异有统计学意义，直肠癌联合用药则以HCPT+MMC和5-FU+MMC最为敏感，敏感率分别为84.31%、82.35 %，而5-FU+CDDP和5-FU+ADM的敏感率较低，分别为46.08%、47.06 %，表明直肠癌对联合用药的敏感性也存在明显差异，这可能与组合的单药充分发挥各自对肿瘤细胞不同的作用靶点优势、克服肿瘤的先天性耐药有关;单药组和联合用药组组间差异有显著统计学意义，联合用药组敏感性明显优于单药组敏感性，表明直肠癌患者化疗应选择联合用药的方案;MMC单用与MMC为主的联合用药敏感性无明显差异，在本组直肠癌中都体现出了较好的敏感性，对于制定直肠癌患者化疗方案具有指导作用;此外，常用化疗药物ADM、CDDP以及其分别与5-FU联合用药的敏感性在本组结果中均较低，这应引起临床消化道肿瘤医师的重视.
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本组直肠癌患者根据肿瘤细胞体外药敏实验结果选择敏感性好的化疗药物和化疗方案进行治疗，其远期疗效值得随访研究;化疗药物的敏感性与直肠癌多药耐药性、患者性别、年龄、直肠癌分期以及病理学类型等诸多问题的相关性，也有待进一步探讨.
4 参考文献1 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvival: application to proliferation and cytotoxicity
assays. J Immun1ol Meth 1983;65:55-63
2 Sargent JM, Taylor CG. Appraisal of the MTT assay as a rapid testof chemosenstivity in acute myeloid leukaemia. Br
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J Cancer 1989;60:206-210
3 Bellamy WT. Prediction of response to drug therapy of cancer: areview of in vitro assays. Drug 1992;44:690-708
4 曾庆华,吕新生, 汤辉焕.MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.中国普通外科杂志 2000;9:552-554
5 黄海茵,郭映华, 于尔辛.体外细胞培养应用于中药复方研究的进展.中国中西医结合杂志 2000;20:394-396
6 汤为学,骆云鹏, 王瑞雪.人实体瘤抗癌药物敏感试验MTT法的建立.重庆医科大学学报 1992;17:103-108
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7 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京: 北京出版社, 1994:133-135
8 张亚历,周殿元, 万田谟,张月彩. 大肠癌个体化疗药敏试验的组织取材及培养方法的探讨.中国肛肠病杂志 1995;15:3-5
9 韩锐.肿瘤化学预防及药物治疗.第2版.北京: 北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社出版, 1991:420-421
10 晏仲舒.大肠癌辅助化疗.中国普通外科杂志 2001;11:641-642
11 钱俊,楼荣灿. 大肠癌辅助化疗进展.国外医学肿瘤学分册 1999; 26:118-120
12 刘冀龙,董新舒, 刘忠臣,田野. 应用RT-PCR方法定量分析大肠癌患者多药耐药基因表达水平及其临床意义.中国肿瘤
, 百拇医药
临床 1999;26:39-41
13 Von Hoff DD. In vitro predictive testing: the sulfonamide era. IntJ Cell Cloning 1987;5:179-190
14 Tomita K, Shimozaki E, Tsuchiya H. Improvement of human tumorclonogenic assay using cell culture in soft part
sarcoma of the extremity. Nippon Gan ChiryoGakkai Shi 1989;24:83-93
15 魏寿江,赵国刚, 王崇树,侯华芳. 大肠癌化疗药敏检测及临床意义.四川医学 2002;23:1243-1244, 百拇医药( 魏寿江, 王崇树, 赵国刚, 侯华芳)
