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编号:10692313
血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞TIMP-1表达的作用
http://www.100md.com 2004年6月15日 《世界华人消化杂志》 2004年第6期
     王磊,刘海林,上海第二医科大学附属第九人民医院消化科 上海市 200011

    项目负责人:刘海林,200011, 上海市制造局路639号,上海第二医科大学附属第九人民医院消化科. liu_hailin@yahoo.com.cn

    电话:021-63138341-5134 传真:021-63136856

    收稿日期:2004-02-06 接受日期:2004-03-02

    摘要

    目的
:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肝星状细胞组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的作用.
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    方法:体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,分别加入不同浓度的AngⅡ(10-6-10-9mol/L)和AngⅡ10-6 moL/L+ Losartan10 -6 mol/L,作用48h后收集细胞,RT-PCR检测各组TIMP-1mRNA表达水平.

    结果:10-6moL/L AngⅡ和10-7moL/LAngⅡ作用的HSC-T6细胞TIMP-1mRNA的表达分别为0.79±0.04和0.83±0.06,显著高于空白对照组0.62±0.08(P <0.05),10-6AngⅡ+10-6 Losartan 组TIMP-1mRNA的表达为0.64±0.06,显著抑制10-6moL/L AngⅡ的作用(P<0.05).
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    结论:AngⅡ可通过AT1受体促进HSC-T6细胞TIMP-1的表达.

    王磊,刘海林. 血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞TIMP-1表达的作用.世界华人消化杂志 2004;12(6):1455-1456

    0 引言最近的研究发现,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种重要的促肝纤维化因子,AngⅡ可通过1型受体(AT1受体)介导促进肝星状细胞(HSC)增生、Ca2+内流和胶原合成[1].但在肝纤维化形成过程中AngⅡ对细胞外基质(ECM)的代谢是否发挥作用尚不十分清楚.组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)通过抑制ECM降解在肝纤维化过程中发挥重要作用.本研究观察了不同浓度AngⅡ和AT1受体拮抗剂对肝星状细胞株HSC-T6的TIMP-1表达的作用.
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    1 材料和方法

    1.1 材料
大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),为美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授建立,上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠;AngⅡ购自Calbiochem公司;AT1受体拮抗剂Losartan为默沙东公司产品;DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司; Trizol试剂盒,购自Sigma公司;Takara RT-PCR试剂盒为Takara公司产品;TIMP-1、b-actin引物由上海生工公司合成.

    1.2 方法 HSC-T6细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液制备为1×106/mL的单细胞悬液,接种于培养皿中,置含50mL/L CO2、37°C培养箱中培养24h,细胞贴壁后换含4mL/L胎牛血清的DMEM培养液,继续培养24h后,换含终浓度为10-6-10-9moL/LAngⅡ及AngⅡ10-6moL/L+Losartan10-6 moL/L的培养液,并设空白对照组,每组3盘细胞.作用48 h后,每盘细胞加1mL Trizol,将细胞收集至经DEPC水处理的Eppendorf管中,-80°C保存.按Trizol试剂盒说明书提取总RNA,溶于20mL0.1 g/L DEPC水中,取溶解的RNA1 mL,用DEPC水稀释100倍,用紫外分光光度仪检测RNA纯度及浓度.逆转录反应体系:RNA 标本2 mg,逆转录酶1mL,dNTP混合物(10mmoL/L) 2 mL,10×PCR缓冲液2mL,MgCl2(25 mmoL/L) 4 mL,RNA酶抑制剂0.5mL,oligodt-Adaptor 引物1mL,其余为无RNA酶水,反应总体积共20mL.cDNA合成反应条件:30 °C,10min; 42 °C,60min; 99 °C,5min; 5 °C,5min. PCR反应体系:逆转录cDNA产物2mL,TIMP-1或b-actin上下游引物(表1)各1mL,Taq酶(5 U/ mL)0.25 mL,dNTP混合物(10mmoL/L) 0.5 mL、10×PCR缓冲液2mL、MgCl2(25 mmoL/L)1.2 mL、其余为无RNA酶水,反应总体积共20mL.PCR反应条件:94 °C预变性2 min; 之后94°C,30s; 56 °C,30s; 72 °C,1.5min; 共35个循环;最后72 °C 10 min,终止反应.PCR扩增产物加2mLDNA上样液混匀,经15g/L琼脂糖凝胶(含1g/L溴化乙啶)电泳后,经GIS-2800凝胶图像处理系统拍照,分析各产物条带平均灰度值,以b-actin产物条带灰度值为内参照计算mRNA相对表达量.
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    统计学处理 SAS统计软件包进行配对t检验.

    表1 引物序列
引物序列扩增长度(bp)位点
TIMP-1顺义 5’-GACCTGGTCATAAGGGCTAAA-3’219118-138
反义 5’-GCCCGTGATGAGAAACTCTTCACT-3'313-336
b-actin顺义 5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’54025-45
反义 5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’541-564

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    2 结果10-6 moL/L AngⅡ组和10-7moL/LAngⅡ组作用的HSC-T6细胞TIMP-1mRNA的表达分别为0.79±0.04和0.83±0.06,显著高于空白对照组0.62±0.08(P <0.05),10-6AngⅡ+10-6Losartan 组TIMP-1mRNA的表达为 0.64±0.06,显著抑制10-6mol/LAngⅡ的作用(P<0.05)(表2、图1).

    表2 不同浓度AngⅡ和Losartan对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA表达的作用 (mean±SD,n =3)
分组(mol/L)TIMP-1mRNA
10-6 AngⅡ0.79±0.04aP =3.29
10-7 AngⅡ0.83±0.06aP =3.64
10-8 AngⅡ0.59±0.05P =0.55
10-9 AngⅡ0.61±0.06P =0.17
空白对照组0.62±0.08
10-6 AngⅡ+10-6Losartan0.64±0.06bP =3.60

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    aP<0.05 vs 空白对照组,bP <0.05 vs 10-6 AngⅡ组.

    图1 1: AngⅡ10-6moL/L; 2: AngⅡ10-7moL/L; 3:AngⅡ10-8 moL/L; 4: AngⅡ10-9 moL/L; 5: 空白对照;6: AngⅡ10-6moL/L+ Losartan 10-6 moL/L; M:标准DNA标记.AngⅡ对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA表达的PCR电泳.

    3 讨论近来研究报道,肝脏中也存在组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)[2],作为RAAS的重要活性成分,AngⅡ在肝纤维化形成中的作用正逐渐引起广泛关注.动物实验表明大鼠分离培养的活化HSC和肝星状细胞株HSC-T6均可表达AT1受体,AT1受体拮抗剂和ACEI对实验性大鼠肝纤维化具有一定的治疗作用[3-4].人活化的HSC同样存在AT1受体表达,AngⅡ可以通过与其受体结合,促进HSC增生、胶原合成和Ca2+内流[1].TIMP-1是TIMP家族的重要成员,在肝纤维化过程中主要来源于活化的HSC,其通过抑制间质金属蛋白酶(MMP)的活性减少细胞外基质的降解,在肝纤维化的形成和发展中发挥十分重要的作用[5].而目前关于AngⅡ是否可以影响HSC的TIMP-1表达尚鲜有报道.
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    HSC-T6是通过转导SV40基因建立的SD大鼠HSC细胞株,具有稳定的活化HSC的生物学特性[6].我们在体外观察了不同浓度(10-6-10-9moL/L)的AngⅡ对HSC-T6细胞的作用.结果提示高浓度的AngⅡ可以促进HSC-T6细胞的TIMP-1mRNA的表达,而且该作用可以被AT1受体拮抗剂抑制,提示AngⅡ可以通过AT1受体的介导直接上调TIMP-1mRNA表达,从而通过抑制ECM降解促进肝纤维化的形成.同期国外亦有研究证明,不同浓度AngⅡ作用于培养的大鼠HSC后,TIMP-1的表达呈浓度和时间依赖性增加.而且此作用可被蛋白激酶C抑制剂所阻断,提示AngⅡ刺激TIMP-1生成的机制可能与蛋白激酶C介导的RNA从头合成途径有关[7].

    因此,AngⅡ可通过上调HSC的TIMP-1参与抑制细胞外基质的降解,促进肝纤维化的形成,AngⅡ对其他肝纤维化相关MMP/TIMP的调节作用如何尚需要深入研究.
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    4 参考文献1 Bataller R, Gines P, Nicolas JM, Gorbig MN, Garcia-Ramallo E,Gasull X, Bosch J, Arroyo V, Rodes J. Angiotensin II induces

    contraction and proliferation of humanhepatic stellate cells. Gastroenterology 2000;118:1149-1156

    2 张晶, 宗春华,李定国, 周仁建,杜学亮, 周馨,徐芹芳, 陆汉明.肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统与大鼠肝纤维化的关系.世

    界华人消化杂志 2002;10:397-400

    3 Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Nakatani T,Tsujinoue H, Fukui H. Angiotensin-II type 1 receptor
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    interaction is a major regulator for liverfibrosis development in rats. Hepatology 2001;34(4 Pt 1):745-750

    4 李乾, 张桂英,李新华, 徐美华.卡托普利对肝纤维化模型鼠MMP-2,3 TIMP-2, 3 表达的影响.世界华人消化杂志

    2003;11:1168-1171

    5 刘海林,李宣海, 杨少平,王丹艺. 金属蛋白酶组织抑制因子-1与肝纤维化.中华消化杂志 2000;20:127-128

    6 Vogel S, Piantedosi R, Frank J, Lalazar A, Rockey DC, Friedman SL,Blaner WS. An immortalized rat liver stellate cell line
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    (HSC-T6): a new cell model for the study ofretinoid metabolism in vitro. J Lipid Res 2000;41:882-893

    7 Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Yanase K,Namisaki T, Yamazaki M, Tsujinoue H, Imazu H, Fukui H.

    Angiotensin-II induces the tissue inhibitorof metalloproteinases-1 through the protein kinase-Csignaling pathway inrat

    liver fibrosis development. Hepatol Res 2003;27:51-56, http://www.100md.com( 王 磊, 刘海林)
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