肝硬化大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能神经的变化
张忠平,张志坚, 张捷,王雯, 林克荣,朱金照, 中国人民解放军第一军医大学福州临床医院,福州总医院消化科 福建省福州市 350025
项目负责人:张志坚,350025, 福建省福州市西二环北路156号,中国人民解放军第一军医大学福州临床医院,福州总医院消化科. zzp180@163.com
电话:0591-2859371
收稿日期:2004-02-03 接受日期:2004-02-24
摘要
目的:探讨肝硬化大鼠肠壁肌间神经丛氮能、胆碱能神经元及神经纤维的变化.
, 百拇医药
方法:30只SD大鼠随机分为肝硬化组和正常组，采用一氧化氮合酶(NOS)及乙酰胆碱酯酶(AchE)组织化学染色技术，在铺片上观察肝硬化大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能神经形态特征并对其分布进行定量研究.
结果:肝硬化大鼠肠壁肌间NOS阳性神经丛排列杂乱，染色模糊，神经元数量减少;Ach阳性神经纤维明显变细.模型组大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能神经分布的密度均显著低于对照组(P<0.05).
结论:肝硬化大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能阳性神经受到损伤.
张忠平,张志坚, 张捷,王雯, 林克荣,朱金照. 肝硬化大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能神经的变化.世界华人消化杂志 2004;12(6):1459-1461
, http://www.100md.com
0 引言肝硬化患者常有不同程度的食欲不振、腹胀、恶心、便秘等胃肠道症状.国内外学者通过一系列实验证实肝硬化患者存在胃肠道动力学障碍.本文作者通过检测肝硬化大鼠肠壁肌间神经丛神经元及神经纤维分布和变化，初步探讨肝硬化患者胃肠动力障碍发生与胃肠神经的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 选用SD♂大鼠，体质量230-250g/只. 将30只SD大鼠随机分为正常组10只和肝硬化模型组20只.
1.2 方法
1.2.1 动物造模 肝硬化组大鼠给予500mL/L四氯化碳石蜡油溶剂皮下注射，每次每只0.2mL/100 g，2次/wk，共30次.取中叶肝脏，HE染色，光镜下检查有无典型假小叶，以证明肝硬化形成.
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1.2.2 制作铺片 取正常组与模型组SD大鼠各10只，每只取空肠和结肠各约10cm，置于40 mL/L多聚甲醛中固定2h (4 °C). 然后取出肠管用TBS缓冲液冲洗后再置于300g/L蔗糖溶液24h，将肠管剪成约lcm长小段，用一玻璃棒伸入肠管使其被动扩张，然后用镊子在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕，用镊尖沿划痕剥离纵肌层，便制成肌间神经丛铺片标本，将其置于TBS中存放.染色采用Kamovsky-Roots直接法显示肠壁肌间神经丛乙酰胆碱能(AchE)神经;NADPH-d组化法显示氮能(NOS)神经.
1.2.3 图像分析 采用MAS-5图像分析系统.选取同一染色条件下AchE和NADP组化片，每张切片于200倍光镜下选取5个视野，观察肌间神经丛中阳性神经元的染色及分布情况，将图像扫描入计算机，通过计算机分析得到阳性表达密度.
统计学处理 数据以mean±SD表示.组间差异采用t检验.
, 百拇医药
2 结果NADP阳性产物为蓝色沉淀.肌间神经丛主要由神经节、节间束及一些含膨体的阳性神经纤维纵横交织呈网格状分布.高倍镜下，阳性神经形态、大小不等，胞质呈蓝色，核不着色，胞体形态多样，有卵圆形、三角形及不规则形.与对照组(图1)比较，肝硬化组(图2)肌间NOS阳性神经丛排列杂乱，染色模糊，神经元数量减少.AchE阳性神经丛为红棕色沉淀.神经节和神经纤维交织形成网状.与对照组(图3)比较，肝硬化组(图4)肌间AchE阳性神经纤维明显变细.肠壁肌间神经丛AchE、NOS染色计算机图像分析结果见(表1).
表1 肠壁肌间神经丛AchE、NOS染色结果(mean±SD,n=10)
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aP<0.05, bP <0.01 vs对照组.
图1对照组空肠肌间神经丛铺片NOS染色图像,神经纤维纵横交织呈网格状胞质呈蓝色,核不着色, ×200.
图2模型组空肠肌间神经丛铺片NOS染色图像,神经丛排列杂乱,神经元数量减少×200.
图3对照组空肠肌间神经丛铺片AchE染色图像,×200.
图4模型组空肠肌间神经丛铺片AchE染色图像,神经纤维明显变细×200.
3 讨论国内外学者认为肝硬化患者出现一系列胃肠道症状，其产生机制主要与以下几方面相关:(1)神经-体液因素:自主神经; 消化道内源性神经系统;神经递质与胃肠激素的改变.(2)炎症递质:白介素-1、干扰素可抑制摄食中枢，使食欲下降，反射性引起胃肠运动减弱.(3)肠道菌群失调:导致胃肠道黏膜病变、内毒素吸收增加、胃肠胀气、消化道出血.(4)内毒素血症:内毒素能造成复杂的病理生理效应，能对神经系统、消化系统等产生严重影响.(5)分泌、吸收障碍.(6)一氧化氮(NO)与一氧化氮合酶:NO重要活性之一是抑制平滑肌收缩，从而使血管扩张.且有研究表明，肝衰竭大鼠近端小肠肠腔及血液内NO高于对照，并与胃肠平滑肌运动障碍显著相关[1].
, 百拇医药
有学者将肝硬化大鼠胃肠黏膜制成石蜡及冰冻切片，通过免疫组织化学和一氧化氮组织化学染色等方法进行研究，发现各类NOS(NOS1，神经型、NOS2，诱导型和NOS3，内皮型)在胃肠道黏膜固有层有相似的分布，主要存在于黏膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOS1还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，NOS2存在于黏膜下层血管内皮细胞.肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数均明显减少[2].
普通切片制作方法只能从某一断面了解肌间神经丛细胞数量的多少，而运用铺片的制作方法却可以显示整个肠道肌间神经丛细胞的数量、形态及神经纤维结构.本文作者将肝硬化大鼠肠壁纵形平滑肌剥离制成铺片，进行NOS和AchE组织化学染色，并将铺片进行计算机图像分析.结果发现肝硬化大鼠肌间神经丛阳性神经元与对照组比较，均出现结构和染色强度的异常.图像分析发现模型组空肠及结肠肌间神经丛一氧化氮合酶、乙酰胆碱酯酶活性均下降，反映所对应神经元功能受影响.乙酰胆碱是胃肠副交感神经的主要递质，对胃肠道的运动、排空有重要作用.现在发现一氧化氮是广泛存在于人体内的生物递质，对抑制平滑肌收缩，扩张血管、胃肠道平滑肌的正常活动起调节作用[3-4].本组实验发现二者在肝硬化胃肠道肌间神经丛的异常，为肝硬化患者出现消化道症状可能与胃肠神经系统受损有关提供了一定的实验证据.
, 百拇医药
4 参考文献1 Wang X, Zhong YX, Zhang ZY, Lu J, Lan M, Miao JY, Guo XG, Shi YQ,Zhao YQ, Ding J, Wu KC, Pan BR, Fan DM. Effect of
L-NAME on nitric oxide and gastrointestinalmotility alterations in cirrhotic rats. World J Gastroenterol 2002;8:328-332
2 王新,闻勤生, 黄裕新.L-NAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合酶亚型表达的影响.第四军医大学学报 2001;22:817-820
3 Xu L, Carter EP, Ohara M, Martin PY, Rogachev B, Morris K,Cadnapaphornchai M, Knotek M, Schrier RW. Neuronal nitric
, 百拇医药
oxide synthase and systemic vasodilation inrats with cirrhosis. Am J Physiol Renal Physiol 2000;279:F1110-1115
4 Yoneda S, Kadowaki M, Kuramoto H, Fukui H, Takaki M.Enhancedcolonic peristalsis by impairment of nitrergic enteric
neurons in spontaneously diabetic rats.Auton Neurosci 2001;92:65-71, http://www.100md.com( 张忠平, 张志坚, 张 捷, 王 雯, 林克荣, 朱金照)
项目负责人:张志坚,350025, 福建省福州市西二环北路156号,中国人民解放军第一军医大学福州临床医院,福州总医院消化科. zzp180@163.com
电话:0591-2859371
收稿日期:2004-02-03 接受日期:2004-02-24
摘要
目的:探讨肝硬化大鼠肠壁肌间神经丛氮能、胆碱能神经元及神经纤维的变化.
, 百拇医药
方法:30只SD大鼠随机分为肝硬化组和正常组，采用一氧化氮合酶(NOS)及乙酰胆碱酯酶(AchE)组织化学染色技术，在铺片上观察肝硬化大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能神经形态特征并对其分布进行定量研究.
结果:肝硬化大鼠肠壁肌间NOS阳性神经丛排列杂乱，染色模糊，神经元数量减少;Ach阳性神经纤维明显变细.模型组大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能神经分布的密度均显著低于对照组(P<0.05).
结论:肝硬化大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能阳性神经受到损伤.
张忠平,张志坚, 张捷,王雯, 林克荣,朱金照. 肝硬化大鼠肠壁肌间氮能、胆碱能神经的变化.世界华人消化杂志 2004;12(6):1459-1461
, http://www.100md.com
0 引言肝硬化患者常有不同程度的食欲不振、腹胀、恶心、便秘等胃肠道症状.国内外学者通过一系列实验证实肝硬化患者存在胃肠道动力学障碍.本文作者通过检测肝硬化大鼠肠壁肌间神经丛神经元及神经纤维分布和变化，初步探讨肝硬化患者胃肠动力障碍发生与胃肠神经的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 选用SD♂大鼠，体质量230-250g/只. 将30只SD大鼠随机分为正常组10只和肝硬化模型组20只.
1.2 方法
1.2.1 动物造模 肝硬化组大鼠给予500mL/L四氯化碳石蜡油溶剂皮下注射，每次每只0.2mL/100 g，2次/wk，共30次.取中叶肝脏，HE染色，光镜下检查有无典型假小叶，以证明肝硬化形成.
, http://www.100md.com
1.2.2 制作铺片 取正常组与模型组SD大鼠各10只，每只取空肠和结肠各约10cm，置于40 mL/L多聚甲醛中固定2h (4 °C). 然后取出肠管用TBS缓冲液冲洗后再置于300g/L蔗糖溶液24h，将肠管剪成约lcm长小段，用一玻璃棒伸入肠管使其被动扩张，然后用镊子在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕，用镊尖沿划痕剥离纵肌层，便制成肌间神经丛铺片标本，将其置于TBS中存放.染色采用Kamovsky-Roots直接法显示肠壁肌间神经丛乙酰胆碱能(AchE)神经;NADPH-d组化法显示氮能(NOS)神经.
1.2.3 图像分析 采用MAS-5图像分析系统.选取同一染色条件下AchE和NADP组化片，每张切片于200倍光镜下选取5个视野，观察肌间神经丛中阳性神经元的染色及分布情况，将图像扫描入计算机，通过计算机分析得到阳性表达密度.
统计学处理 数据以mean±SD表示.组间差异采用t检验.
, 百拇医药
2 结果NADP阳性产物为蓝色沉淀.肌间神经丛主要由神经节、节间束及一些含膨体的阳性神经纤维纵横交织呈网格状分布.高倍镜下，阳性神经形态、大小不等，胞质呈蓝色，核不着色，胞体形态多样，有卵圆形、三角形及不规则形.与对照组(图1)比较，肝硬化组(图2)肌间NOS阳性神经丛排列杂乱，染色模糊，神经元数量减少.AchE阳性神经丛为红棕色沉淀.神经节和神经纤维交织形成网状.与对照组(图3)比较，肝硬化组(图4)肌间AchE阳性神经纤维明显变细.肠壁肌间神经丛AchE、NOS染色计算机图像分析结果见(表1).
表1 肠壁肌间神经丛AchE、NOS染色结果(mean±SD,n=10)
| 组别 | AchE | NOS |
| 对照组空肠 | 11.34±1.42 | 6.51±0.70 |
| 模型组空肠 | 9.62±1.25a | 5.80±0.47b |
| 对照组结肠 | 13.18±2.30 | 8.52±0.64 |
| 模型组结肠 | 10.24±0.97a | 7.71±0.79b |
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aP<0.05, bP <0.01 vs对照组.
图1对照组空肠肌间神经丛铺片NOS染色图像,神经纤维纵横交织呈网格状胞质呈蓝色,核不着色, ×200.
图2模型组空肠肌间神经丛铺片NOS染色图像,神经丛排列杂乱,神经元数量减少×200.
图3对照组空肠肌间神经丛铺片AchE染色图像,×200.
图4模型组空肠肌间神经丛铺片AchE染色图像,神经纤维明显变细×200.
3 讨论国内外学者认为肝硬化患者出现一系列胃肠道症状，其产生机制主要与以下几方面相关:(1)神经-体液因素:自主神经; 消化道内源性神经系统;神经递质与胃肠激素的改变.(2)炎症递质:白介素-1、干扰素可抑制摄食中枢，使食欲下降，反射性引起胃肠运动减弱.(3)肠道菌群失调:导致胃肠道黏膜病变、内毒素吸收增加、胃肠胀气、消化道出血.(4)内毒素血症:内毒素能造成复杂的病理生理效应，能对神经系统、消化系统等产生严重影响.(5)分泌、吸收障碍.(6)一氧化氮(NO)与一氧化氮合酶:NO重要活性之一是抑制平滑肌收缩，从而使血管扩张.且有研究表明，肝衰竭大鼠近端小肠肠腔及血液内NO高于对照，并与胃肠平滑肌运动障碍显著相关[1].
, 百拇医药
有学者将肝硬化大鼠胃肠黏膜制成石蜡及冰冻切片，通过免疫组织化学和一氧化氮组织化学染色等方法进行研究，发现各类NOS(NOS1，神经型、NOS2，诱导型和NOS3，内皮型)在胃肠道黏膜固有层有相似的分布，主要存在于黏膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOS1还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，NOS2存在于黏膜下层血管内皮细胞.肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数均明显减少[2].
普通切片制作方法只能从某一断面了解肌间神经丛细胞数量的多少，而运用铺片的制作方法却可以显示整个肠道肌间神经丛细胞的数量、形态及神经纤维结构.本文作者将肝硬化大鼠肠壁纵形平滑肌剥离制成铺片，进行NOS和AchE组织化学染色，并将铺片进行计算机图像分析.结果发现肝硬化大鼠肌间神经丛阳性神经元与对照组比较，均出现结构和染色强度的异常.图像分析发现模型组空肠及结肠肌间神经丛一氧化氮合酶、乙酰胆碱酯酶活性均下降，反映所对应神经元功能受影响.乙酰胆碱是胃肠副交感神经的主要递质，对胃肠道的运动、排空有重要作用.现在发现一氧化氮是广泛存在于人体内的生物递质，对抑制平滑肌收缩，扩张血管、胃肠道平滑肌的正常活动起调节作用[3-4].本组实验发现二者在肝硬化胃肠道肌间神经丛的异常，为肝硬化患者出现消化道症状可能与胃肠神经系统受损有关提供了一定的实验证据.
, 百拇医药
4 参考文献1 Wang X, Zhong YX, Zhang ZY, Lu J, Lan M, Miao JY, Guo XG, Shi YQ,Zhao YQ, Ding J, Wu KC, Pan BR, Fan DM. Effect of
L-NAME on nitric oxide and gastrointestinalmotility alterations in cirrhotic rats. World J Gastroenterol 2002;8:328-332
2 王新,闻勤生, 黄裕新.L-NAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合酶亚型表达的影响.第四军医大学学报 2001;22:817-820
3 Xu L, Carter EP, Ohara M, Martin PY, Rogachev B, Morris K,Cadnapaphornchai M, Knotek M, Schrier RW. Neuronal nitric
, 百拇医药
oxide synthase and systemic vasodilation inrats with cirrhosis. Am J Physiol Renal Physiol 2000;279:F1110-1115
4 Yoneda S, Kadowaki M, Kuramoto H, Fukui H, Takaki M.Enhancedcolonic peristalsis by impairment of nitrergic enteric
neurons in spontaneously diabetic rats.Auton Neurosci 2001;92:65-71, http://www.100md.com( 张忠平, 张志坚, 张 捷, 王 雯, 林克荣, 朱金照)
