细胞黏附对结肠癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响
梁后杰,李德明, 胡绍毅,边志衡, 黄海辉,何建明,中国人民解放军第三军医大学西南医院肿瘤科 重庆市 400038
国家自然科学基金资助项目,No. 30171067
项目负责人:梁后杰,400038, 重庆市,中国人民解放军第三军医大学西南医院肿瘤科. lianghoujie@sina.com
电话:023-68754128
收稿日期:2004-04-15 接受日期:2004-05-13
摘要
, http://www.100md.com 目的:研究结肠癌细胞株与基质黏附对肿瘤细胞凋亡及药物敏感性的影响.
方法:应用MTT法研究细胞与基质成分纤维粘连蛋白(FN)结合对药物敏感性的影响;采用TUNEL法检测细胞凋亡，采用流式细胞术观察Bcl-2和Bax基因表达.
结果:HT29细胞与FN结合后，其耐药性明显增加(抑制率为12.2%，对照组为53.0%，P<0.01)，用抗b-1整合素抗体阻断其与FN结合，其对药物的敏感性又恢复至对照水平(抑制率为50.6%，与对照组比P<0.05); HT29细胞与FN结合后，Bcl-2基因蛋白表达上升(62.1%)，Bax表达降低(12.86%)，凋亡率(8.75±1.08%)显著降低，对照组为(19.46±1.08%);阻断其与FN结合，Bcl-2表达明显下降(22.68%)，而Bax表达上升(73.8%)，凋亡率也升至(18.9±1.4%)(与对照组比Р<0.05).
, 百拇医药
结论:肿瘤细胞与基质成分结合可上调Bax和下调Bcl-2基因表达，增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，从而增加肿瘤耐药性.
梁后杰,李德明, 胡绍毅,边志衡, 黄海辉,何建明. 细胞黏附对结肠癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响.世界华人消化杂志 2004;12(8):1943-1944
0 引言结肠癌对化疗的耐药现象是影响其疗效和预后的重要因素.为克服肿瘤耐药，多年来人们对肿瘤的耐药机制进行了大量研究，既往的研究结果均有赖于体外二维单层培养的肿瘤细胞，而人体内存在的是实体瘤，是一个三维的细胞群集体.因此，要克服耐药不仅要阐明肿瘤细胞个体的耐药特性，更要考虑到黏附作用所介导的肿瘤细胞-细胞、细胞-细胞外基质间的相互作用[1].我们采用结肠癌HT29细胞株观察肿瘤细胞与基质成分纤连蛋白(FN)结合后肿瘤细胞凋亡及对药物敏感性的变化，并观察阻断细胞与基质黏附对肿瘤耐药性的影响，从而为结肠癌的耐药机制及逆转研究提供新的思路.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 结肠癌细胞株HT29由我院实验中心提供.鼠抗人b-1整合素抗体(美国Chemicon)，纤维粘连蛋白(美国Chemicon公司)，原位细胞凋亡检测试剂盒(SantaCruz公司)，PRMI1640培养基(美国Gibco)，四甲基氮唑蓝(MTT)及DMSO(Sigma).
1.2 方法 分别设A549细胞组、A549细胞+FN、A549细胞+b-1整合素抗体组、A549细胞+FN+b-1整合素抗体组.每组设6复孔，抗体工作浓度为1:50.取96 孔培养板，无菌条件下在相应实验组加FN，3mg/孔，使之涂满孔底表面，4°C冰箱过夜，37°C，50mL/L CO2恒温孵箱6h，分别给予5-Fu10 mmol/L，同时在相应实验孔加抗b-1整合素抗体4mg/孔，孵育48h，对照组不加药物及抗体.快速翻转培养板，去除培养液，每孔加入25mLMTT(终浓度5moL/L)继续培养4h，加入DMSO100uL，震荡10min，待紫蓝色颗粒完全溶解，在酶联免疫检测仪以490nm 为检测波长，测各孔的A490值，根据下列公式计算抑制率:抑制率＝(1-实验组A490值/对照组A490值)×100%.TUNEL法检测细胞凋亡按原位细胞凋亡检测试剂盒要求操作，在免疫荧光显微镜下检测阳性细胞数，然后DAB显色，摄影，数据统计学处理.流式细胞仪检测凋亡基因Bcl-2，Bax的表达:细胞消化后经离心、固定、再离心后加入FACS标记液，按实验要求依次加入Bcl-2，Bax抗体，孵育30min后，加入FITC标记IgG荧光(二抗)，避光，离心，上机待检.
, 百拇医药
统计学处理 全部资料数据均以mean±SD表示，显著性检验用t检验.
2 结果HT29细胞与FN结合后，其耐药性明显增加(抑制率为12.2%，对照组为53.0%(P<0.01)，用抗b-1整合素抗体阻断其与FN结合，其对药物的敏感性又恢复至对照水平(抑制率为50.6%，与对照组比P<0.05). HT29细胞株结合FN后凋亡率为8.8±1.1%，较未结合FN实验组(19.5±1.1%)显著降低.阻断其与FN结合，凋亡率升至(18.9±1.4%)(与对照组比Р<0.05).HT29细胞通过b-l整合素与FN结合后Bcl-2基因蛋白表达上升(62.1%)，Bax表达降低(12.9%)，阻断b-l整合素后，Bcl-2表达明显下降(22.7%)，而Bax表达上升(73.8%).
3 讨论细胞群集时药物敏感性的降低并非由于或并非仅仅由于药物不易进入所致，而可能主要与细胞-细胞或细胞-基质的相互作用所致的整个细胞群体的耐药表型改变有关[2-5].我们研究发现当肿瘤细胞与基质成分FN结合后，其耐药性较单层培养明显增加，进一步证实了细胞黏附在肿瘤耐药中的作用.细胞黏附由几个黏附分子家族所介导(包括选择素家族，CD44家族、整合素家族、钙粘素家族等)，已证明这些黏附分子与细胞间和细胞内信号传导有关，并可通过对细胞周期和凋亡的调控，影响对治疗的反应.已知许多抗癌药物可通过诱导癌细胞凋亡而达到抗癌作用，所以细胞凋亡能力可直接影响抗癌药物的效应[6-7].我们发现，HT29细胞与FN结合后，其Bax蛋白表达增加，而Bcl-2蛋白表达下降，细胞凋亡减少，提示肿瘤细胞与基质的结合，可能通过上调Bax和下调Bcl-2基因的表达，使致肿瘤细胞的抗凋亡能力增强，从而增加细胞的耐药性.
, http://www.100md.com
肿瘤本身作为一个整体具有与其单个癌细胞不同的特性.然而目前许多治疗药物的筛选和临床前研究仍采用的是单层培养系统(保持的基本上仍是单个细胞的特性)，而忽略了细胞间的相互作用.要想成功治疗肿瘤(特别是实体瘤)，肿瘤的这种特性必须予以重视.我们应用b-1整合素抗体阻断细胞与基质的结合，发现A549-ADR细胞凋亡增加，同时也增加了肿瘤细胞对药物的敏感性.因此针对破坏细胞黏附的手段与化疗药联合应用，将可能成为化疗增敏或逆转耐药的一个新的策略.
4 参考文献1 梁后杰,黄海辉. 细胞黏附与肿瘤多细胞耐药.第三军医大学学报 2002;24:1257-1258
2 Rasey JS, Cornwell MM, Maurer BJ, Boyles DJ, Hofstrand P, Chin L,Cerveny C. Growth and radiation response of cells
, http://www.100md.com
grown in macroporous gelatin microcarriers(CultiSpher-GTM). Br J Cancer l996;74(Suppl):S78-S81
3 Taylor ST, Hickman JA, Dive C. Epigenetic determinants ofresistance to etoposide regulation of bcl-XL and Bax by tumor
microenvironmental factors. J Natl CancerInst 2000;92:18-25
4 Han EKH, Tahir SK, Cherian SP, Collins N, Ng SC. Modulation ofpaclitaxel resistance by annexin IV in human cancer
, 百拇医药
cell lines. Br J Cancer 2000;83:83-88
5 Netti PA, Berk DA, Swartz MA, Grodzinsky AJ, Jain RK. Role ofextracellular matrix assembly in interstitial transport in
solid tumors. Cancer Res 2000;60:2497-2503
6 Ogiso Y, Tomida A, Lei S, Omura S, Tsuruo T. Proteasome inhibitioncircumvents solid tumor resistance to
topoisomerase II-directed drugs. Cancer Res 2000;60:2429-2437
7 Ramp U, Dejosez M, Mahotka C, Czarnotta B, Kalinski T, Wenzel M,Lorenz I, Muller M, Krammer P, Gabbert HE, Gerharz
CD. Deficient activation of CD95(APO-l/Fas)-mediated apoptosis:a potential factor ofmultidrug resistance in human
renal cell carcinoma. Br J Cancer 2000;82:1851-1859, http://www.100md.com( 梁后杰, 李德明, 胡绍毅, 边志衡, 黄海辉, 何建明)
国家自然科学基金资助项目,No. 30171067
项目负责人:梁后杰,400038, 重庆市,中国人民解放军第三军医大学西南医院肿瘤科. lianghoujie@sina.com
电话:023-68754128
收稿日期:2004-04-15 接受日期:2004-05-13
摘要
, http://www.100md.com 目的:研究结肠癌细胞株与基质黏附对肿瘤细胞凋亡及药物敏感性的影响.
方法:应用MTT法研究细胞与基质成分纤维粘连蛋白(FN)结合对药物敏感性的影响;采用TUNEL法检测细胞凋亡，采用流式细胞术观察Bcl-2和Bax基因表达.
结果:HT29细胞与FN结合后，其耐药性明显增加(抑制率为12.2%，对照组为53.0%，P<0.01)，用抗b-1整合素抗体阻断其与FN结合，其对药物的敏感性又恢复至对照水平(抑制率为50.6%，与对照组比P<0.05); HT29细胞与FN结合后，Bcl-2基因蛋白表达上升(62.1%)，Bax表达降低(12.86%)，凋亡率(8.75±1.08%)显著降低，对照组为(19.46±1.08%);阻断其与FN结合，Bcl-2表达明显下降(22.68%)，而Bax表达上升(73.8%)，凋亡率也升至(18.9±1.4%)(与对照组比Р<0.05).
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结论:肿瘤细胞与基质成分结合可上调Bax和下调Bcl-2基因表达，增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，从而增加肿瘤耐药性.
梁后杰,李德明, 胡绍毅,边志衡, 黄海辉,何建明. 细胞黏附对结肠癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响.世界华人消化杂志 2004;12(8):1943-1944
0 引言结肠癌对化疗的耐药现象是影响其疗效和预后的重要因素.为克服肿瘤耐药，多年来人们对肿瘤的耐药机制进行了大量研究，既往的研究结果均有赖于体外二维单层培养的肿瘤细胞，而人体内存在的是实体瘤，是一个三维的细胞群集体.因此，要克服耐药不仅要阐明肿瘤细胞个体的耐药特性，更要考虑到黏附作用所介导的肿瘤细胞-细胞、细胞-细胞外基质间的相互作用[1].我们采用结肠癌HT29细胞株观察肿瘤细胞与基质成分纤连蛋白(FN)结合后肿瘤细胞凋亡及对药物敏感性的变化，并观察阻断细胞与基质黏附对肿瘤耐药性的影响，从而为结肠癌的耐药机制及逆转研究提供新的思路.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 结肠癌细胞株HT29由我院实验中心提供.鼠抗人b-1整合素抗体(美国Chemicon)，纤维粘连蛋白(美国Chemicon公司)，原位细胞凋亡检测试剂盒(SantaCruz公司)，PRMI1640培养基(美国Gibco)，四甲基氮唑蓝(MTT)及DMSO(Sigma).
1.2 方法 分别设A549细胞组、A549细胞+FN、A549细胞+b-1整合素抗体组、A549细胞+FN+b-1整合素抗体组.每组设6复孔，抗体工作浓度为1:50.取96 孔培养板，无菌条件下在相应实验组加FN，3mg/孔，使之涂满孔底表面，4°C冰箱过夜，37°C，50mL/L CO2恒温孵箱6h，分别给予5-Fu10 mmol/L，同时在相应实验孔加抗b-1整合素抗体4mg/孔，孵育48h，对照组不加药物及抗体.快速翻转培养板，去除培养液，每孔加入25mLMTT(终浓度5moL/L)继续培养4h，加入DMSO100uL，震荡10min，待紫蓝色颗粒完全溶解，在酶联免疫检测仪以490nm 为检测波长，测各孔的A490值，根据下列公式计算抑制率:抑制率＝(1-实验组A490值/对照组A490值)×100%.TUNEL法检测细胞凋亡按原位细胞凋亡检测试剂盒要求操作，在免疫荧光显微镜下检测阳性细胞数，然后DAB显色，摄影，数据统计学处理.流式细胞仪检测凋亡基因Bcl-2，Bax的表达:细胞消化后经离心、固定、再离心后加入FACS标记液，按实验要求依次加入Bcl-2，Bax抗体，孵育30min后，加入FITC标记IgG荧光(二抗)，避光，离心，上机待检.
, 百拇医药
统计学处理 全部资料数据均以mean±SD表示，显著性检验用t检验.
2 结果HT29细胞与FN结合后，其耐药性明显增加(抑制率为12.2%，对照组为53.0%(P<0.01)，用抗b-1整合素抗体阻断其与FN结合，其对药物的敏感性又恢复至对照水平(抑制率为50.6%，与对照组比P<0.05). HT29细胞株结合FN后凋亡率为8.8±1.1%，较未结合FN实验组(19.5±1.1%)显著降低.阻断其与FN结合，凋亡率升至(18.9±1.4%)(与对照组比Р<0.05).HT29细胞通过b-l整合素与FN结合后Bcl-2基因蛋白表达上升(62.1%)，Bax表达降低(12.9%)，阻断b-l整合素后，Bcl-2表达明显下降(22.7%)，而Bax表达上升(73.8%).
3 讨论细胞群集时药物敏感性的降低并非由于或并非仅仅由于药物不易进入所致，而可能主要与细胞-细胞或细胞-基质的相互作用所致的整个细胞群体的耐药表型改变有关[2-5].我们研究发现当肿瘤细胞与基质成分FN结合后，其耐药性较单层培养明显增加，进一步证实了细胞黏附在肿瘤耐药中的作用.细胞黏附由几个黏附分子家族所介导(包括选择素家族，CD44家族、整合素家族、钙粘素家族等)，已证明这些黏附分子与细胞间和细胞内信号传导有关，并可通过对细胞周期和凋亡的调控，影响对治疗的反应.已知许多抗癌药物可通过诱导癌细胞凋亡而达到抗癌作用，所以细胞凋亡能力可直接影响抗癌药物的效应[6-7].我们发现，HT29细胞与FN结合后，其Bax蛋白表达增加，而Bcl-2蛋白表达下降，细胞凋亡减少，提示肿瘤细胞与基质的结合，可能通过上调Bax和下调Bcl-2基因的表达，使致肿瘤细胞的抗凋亡能力增强，从而增加细胞的耐药性.
, http://www.100md.com
肿瘤本身作为一个整体具有与其单个癌细胞不同的特性.然而目前许多治疗药物的筛选和临床前研究仍采用的是单层培养系统(保持的基本上仍是单个细胞的特性)，而忽略了细胞间的相互作用.要想成功治疗肿瘤(特别是实体瘤)，肿瘤的这种特性必须予以重视.我们应用b-1整合素抗体阻断细胞与基质的结合，发现A549-ADR细胞凋亡增加，同时也增加了肿瘤细胞对药物的敏感性.因此针对破坏细胞黏附的手段与化疗药联合应用，将可能成为化疗增敏或逆转耐药的一个新的策略.
4 参考文献1 梁后杰,黄海辉. 细胞黏附与肿瘤多细胞耐药.第三军医大学学报 2002;24:1257-1258
2 Rasey JS, Cornwell MM, Maurer BJ, Boyles DJ, Hofstrand P, Chin L,Cerveny C. Growth and radiation response of cells
, http://www.100md.com
grown in macroporous gelatin microcarriers(CultiSpher-GTM). Br J Cancer l996;74(Suppl):S78-S81
3 Taylor ST, Hickman JA, Dive C. Epigenetic determinants ofresistance to etoposide regulation of bcl-XL and Bax by tumor
microenvironmental factors. J Natl CancerInst 2000;92:18-25
4 Han EKH, Tahir SK, Cherian SP, Collins N, Ng SC. Modulation ofpaclitaxel resistance by annexin IV in human cancer
, 百拇医药
cell lines. Br J Cancer 2000;83:83-88
5 Netti PA, Berk DA, Swartz MA, Grodzinsky AJ, Jain RK. Role ofextracellular matrix assembly in interstitial transport in
solid tumors. Cancer Res 2000;60:2497-2503
6 Ogiso Y, Tomida A, Lei S, Omura S, Tsuruo T. Proteasome inhibitioncircumvents solid tumor resistance to
topoisomerase II-directed drugs. Cancer Res 2000;60:2429-2437
7 Ramp U, Dejosez M, Mahotka C, Czarnotta B, Kalinski T, Wenzel M,Lorenz I, Muller M, Krammer P, Gabbert HE, Gerharz
CD. Deficient activation of CD95(APO-l/Fas)-mediated apoptosis:a potential factor ofmultidrug resistance in human
renal cell carcinoma. Br J Cancer 2000;82:1851-1859, http://www.100md.com( 梁后杰, 李德明, 胡绍毅, 边志衡, 黄海辉, 何建明)
