大鼠骨髓间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增生的关系
张刚庆,方驰华, 池达智,中国人民解放军第一军医大学珠江医院普外科 广东省广州市 510282
广东省自然科学基金资助课题,No.2001, 010593
项目负责人:方驰华,510282, 广东省广州市,中国人民解放军第一军医大学珠江医院普外科. zhanggq@hotmail.com
电话:020-61643211 传真:020-61643020
收稿日期:2004-02-03 接受日期:2004-02-21
摘要
, http://www.100md.com
目的: 探索成体大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养方法，观察采用不同的换液频度与细胞增生和生长的关系，为其应用提供实验依据.
方法:从大鼠股骨获取骨髓，采用梯度离心的方法进行分离，在含10mL/L胎牛血清的DMEM中常规培养，以MTT法检测不同的时间换液时细胞的生长曲线，并用碱性磷酸酶(AKP)检测的方法对分离的细胞进行鉴定.
结果:采用梯度离心方法分离的骨髓间质干细胞的纯度较高，细胞活性佳，AKP染色为强阴性.首次换液后，每天更换培养液比每隔3-4d换液一次更有利于MSCs的增生，原代长满培养瓶底比每隔2-3 d换液一次平均提前2d.
结论:采用梯度离心的方法分离可获得纯度较高的骨髓间质干细胞，是简单易行的分离方法，每天更换培养液比每隔3-4d换液一次更有利于MSCs的增生和形成形态均一的细胞集落.
, 百拇医药
张刚庆,方驰华, 池达智.大鼠骨髓间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增生的关系.世界华人消化杂志 2004;12(8):1953-1955
0 引言骨髓间质干细胞(mesenchymalstem cells，MSCs)在特定的条件下可以分化为多种组织和细胞[1-5]，并且外源基因易于导入和表达，是潜在的基因治疗和干细胞研究的靶细胞.本研究采用了梯度离心的方法分离间质干细胞，并观察不同的更换培养液的频度与细胞增生、生长的关系，以探索成体大鼠的骨髓MSCs在体外分离、培养和增生较为简便、有效和实用的方法，为其应用提供基础实验依据.
1 材料和方法
1.l 材料 培养板、培养瓶(Sigma公司)，SD大鼠(第一军医大学实验动物中心提供).高糖DMEM、胎牛血清(Gibco.BRL公司).Percoll 分离液(Pharmacia公司).
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 实验分组 根据更换细胞培养液时间的不同分为三组:A组: 接种后每24h更换培养液;B组: 接种后每48h更换培养液;C组: 接种后每72h更换培养液.
1.2.2 MSCs的分离 用比重为 1.073g/mL的percoll，采用梯度离心的方法获取有核细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，分别接种于24孔、96孔培养板和25mL培养瓶，每孔或每瓶的细胞数和培养液量相同，在相同培养条件下进行培养，按实验设计分组的时间和方法更换培养液.
1.2.3 生长曲线绘制 自培养24h开始，每天随机分别取各组细胞4孔，以MTT比色法测定生长曲线[6].
, 百拇医药
统计学处理 SPSS软件，采用方差分析.
2 结果
2.1 MSCs的形态学观察 倒置显微镜下观察，采用Percoll梯度分离液分离成体大鼠的骨髓，所获得的细胞绝大部分为球形的MSCs，其他细胞少见，各组细胞进行AKP染色，均呈阴性.接种后24h内，单个核细胞贴壁.48 h可见部分已贴壁的细胞开始分裂增生，细胞形态多样:三角形、梭形、圆形等(图1).5-7 d，贴壁细胞体积增大，可见多核的成纤维样细胞，细胞有长杆状、三角形、多边形细胞等(图2).在细胞生长增生过程中，A组细胞增生明显，生长状态均最好，B组次之、C组细胞增生较慢，细胞生长状态也较差.培养第10-12 d，细胞开始形成形态较为均一的细胞增生集落，呈梭形或多角形，A组细胞生长增生减慢，B、C组细胞增生相对加快.
, http://www.100md.com
2.2 生长曲线 更换培养液的频度不同，细胞的增生过程和形态变化时间不同，A组的细胞生长增生较快，平均比B、C组达到的同样细胞数提前2-3d. 统计学检验，A组与B、C组之间差异显著(P<0.05)，B组与C组之间的差异不显著(P>0.05)(3图).每日更换培养液的细胞生长状态好于每3d更换培养液的细胞的生长状态.
图1 梯度离心分离培养48h的MSCs细胞(×40).
图2 梯度离心分离培养6d的MSCs细胞(×40).
图3(PDF)不同的更换细胞液的频度与细胞的生长增生关系曲线.
3 讨论骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能，具有独特的细胞增生分裂模式，使外源基因易于导入和表达，而使其成为潜在的基因治疗靶细胞[2]，是细胞治疗的基础.但困扰MSCs广泛应用的主要原因是，较高纯度的MSCs的获取方法、培养增生方法和增生时间.目前对于骨髓中的 MSCs的分离纯化的方法主要有:贴附细胞分离法、流式细胞分离、免疫磁珠分离、梯度离心分离[7-8].每种方法各有优缺点:贴附细胞分离法，简单，易操作，但所得细胞的成分复杂，骨髓MSC的纯度有限;流式细胞仪、免疫磁珠分离，获得的MSCs纯度较高，但操作繁杂，需要昂贵的仪器和试剂，成本较高，并且对细胞的活性影响较大;梯度离心分离，操作方法简单，实验结果证明可取得较高纯度的MSCs. 目前对于骨髓间质干细胞的检测鉴定尚无特定的方法和特异性指标，应用较多的是采用AKP染色法[9].本实验各组培养所得的细胞，经AKP染色，均呈阴性，但各组之间尚存在一定差异，特别是经过加大培养过程中的更换培养液的频度，每天更换培养液，可使获得的MSCs的纯度进一步得到提高.
, http://www.100md.com
本实验采用Percoll梯度分离液行离心分离的方法，成体大鼠的骨髓MSCs分离后，经体外培养能大量增生，并形成细胞形态较为均一的细胞增生集落.骨髓 MSCs的培养生长曲线显示，MSCs在体外培养条件下生长与其他细胞一样经历了生长缓滞期、对数增生期和生长平稳期.从生长曲线可以看出，当细胞增生到一定程度，当细胞长满培养器皿的整个底部时，细胞的增生放慢，可能是细胞间的接触、生长空间缺乏所致.不同的更换培养液的频度对细胞的生长增生有不同的影响，每天更换培养液，细胞增生较快，生长良好，比目前国内外所报道的隔日或每3d更换培养液早2-3d达到细胞形态、大小均一和长满瓶底.其可能原因是，每日更换培养液，可尽早清除非帖壁细胞和生长较差贴壁不牢固的细胞，消除其对贴壁的基质干细胞生长增生的影响;每日更换培养液，可清除培养液中的不利于基质干细胞生长增生的某些物质，其进一步机制和原因有待于深入研究.
4 参考文献1 龚加庆,方驰华. 成人肝脏干细胞研究现状及展望.中华外科杂志 2002;40:385-387
, 百拇医药
2 Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD. Humanmesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte
phenotype in the adult murine heart.Circulation 2002;105:93-98
3 Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Limana F, Jakoniuk I, Quaini F,Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Mobilized
bone marrow cells repair the infarctedheart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci USA
, http://www.100md.com
2001;98:10344-10349
4 Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey PG. Bone marrow stromalstem cells: nature, biology, and potential
applications. Stem Cells 2001;19:180-192
5 马俊勋,方驰华. 卵圆细胞及其与原发性肝癌关系的研究进展.世界华人消化杂志 2002;10:448-451
6 张刚庆,卿三华, 齐德林.热疗联合丝裂霉素对大肠癌细胞的影响.中国胃肠外科杂志 1998;1:85-87
7 傅文玉,路艳蒙, 朴英杰.人骨髓间充质干细胞的培养及多能性研究.中华血液学杂志 2002;23:202-204
, 百拇医药
8 Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD,Ortiz-Gonzalez XR, Reyes M, Lenvik T, Lund T,Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A,Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM. Pluripotency of mesenchymalstem
cells derived from adult marrow. Nature 2002;418:41-49
9 Alison MR, Poulsom R, Jeffery R, Dhillon AP, Quaglia A, Jacob J,Novelli M, Prentice G, Williamson J, Wright NA.
Hepatocytes from non-hepatic adult stemcells. Nature 2000;406:257, http://www.100md.com( 张刚庆, 方驰华, 池达智)
广东省自然科学基金资助课题,No.2001, 010593
项目负责人:方驰华,510282, 广东省广州市,中国人民解放军第一军医大学珠江医院普外科. zhanggq@hotmail.com
电话:020-61643211 传真:020-61643020
收稿日期:2004-02-03 接受日期:2004-02-21
摘要
, http://www.100md.com
目的: 探索成体大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养方法，观察采用不同的换液频度与细胞增生和生长的关系，为其应用提供实验依据.
方法:从大鼠股骨获取骨髓，采用梯度离心的方法进行分离，在含10mL/L胎牛血清的DMEM中常规培养，以MTT法检测不同的时间换液时细胞的生长曲线，并用碱性磷酸酶(AKP)检测的方法对分离的细胞进行鉴定.
结果:采用梯度离心方法分离的骨髓间质干细胞的纯度较高，细胞活性佳，AKP染色为强阴性.首次换液后，每天更换培养液比每隔3-4d换液一次更有利于MSCs的增生，原代长满培养瓶底比每隔2-3 d换液一次平均提前2d.
结论:采用梯度离心的方法分离可获得纯度较高的骨髓间质干细胞，是简单易行的分离方法，每天更换培养液比每隔3-4d换液一次更有利于MSCs的增生和形成形态均一的细胞集落.
, 百拇医药
张刚庆,方驰华, 池达智.大鼠骨髓间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增生的关系.世界华人消化杂志 2004;12(8):1953-1955
0 引言骨髓间质干细胞(mesenchymalstem cells，MSCs)在特定的条件下可以分化为多种组织和细胞[1-5]，并且外源基因易于导入和表达，是潜在的基因治疗和干细胞研究的靶细胞.本研究采用了梯度离心的方法分离间质干细胞，并观察不同的更换培养液的频度与细胞增生、生长的关系，以探索成体大鼠的骨髓MSCs在体外分离、培养和增生较为简便、有效和实用的方法，为其应用提供基础实验依据.
1 材料和方法
1.l 材料 培养板、培养瓶(Sigma公司)，SD大鼠(第一军医大学实验动物中心提供).高糖DMEM、胎牛血清(Gibco.BRL公司).Percoll 分离液(Pharmacia公司).
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 实验分组 根据更换细胞培养液时间的不同分为三组:A组: 接种后每24h更换培养液;B组: 接种后每48h更换培养液;C组: 接种后每72h更换培养液.
1.2.2 MSCs的分离 用比重为 1.073g/mL的percoll，采用梯度离心的方法获取有核细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，分别接种于24孔、96孔培养板和25mL培养瓶，每孔或每瓶的细胞数和培养液量相同，在相同培养条件下进行培养，按实验设计分组的时间和方法更换培养液.
1.2.3 生长曲线绘制 自培养24h开始，每天随机分别取各组细胞4孔，以MTT比色法测定生长曲线[6].
, 百拇医药
统计学处理 SPSS软件，采用方差分析.
2 结果
2.1 MSCs的形态学观察 倒置显微镜下观察，采用Percoll梯度分离液分离成体大鼠的骨髓，所获得的细胞绝大部分为球形的MSCs，其他细胞少见，各组细胞进行AKP染色，均呈阴性.接种后24h内，单个核细胞贴壁.48 h可见部分已贴壁的细胞开始分裂增生，细胞形态多样:三角形、梭形、圆形等(图1).5-7 d，贴壁细胞体积增大，可见多核的成纤维样细胞，细胞有长杆状、三角形、多边形细胞等(图2).在细胞生长增生过程中，A组细胞增生明显，生长状态均最好，B组次之、C组细胞增生较慢，细胞生长状态也较差.培养第10-12 d，细胞开始形成形态较为均一的细胞增生集落，呈梭形或多角形，A组细胞生长增生减慢，B、C组细胞增生相对加快.
, http://www.100md.com
2.2 生长曲线 更换培养液的频度不同，细胞的增生过程和形态变化时间不同，A组的细胞生长增生较快，平均比B、C组达到的同样细胞数提前2-3d. 统计学检验，A组与B、C组之间差异显著(P<0.05)，B组与C组之间的差异不显著(P>0.05)(3图).每日更换培养液的细胞生长状态好于每3d更换培养液的细胞的生长状态.
图1 梯度离心分离培养48h的MSCs细胞(×40).
图2 梯度离心分离培养6d的MSCs细胞(×40).
图3(PDF)不同的更换细胞液的频度与细胞的生长增生关系曲线.
3 讨论骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能，具有独特的细胞增生分裂模式，使外源基因易于导入和表达，而使其成为潜在的基因治疗靶细胞[2]，是细胞治疗的基础.但困扰MSCs广泛应用的主要原因是，较高纯度的MSCs的获取方法、培养增生方法和增生时间.目前对于骨髓中的 MSCs的分离纯化的方法主要有:贴附细胞分离法、流式细胞分离、免疫磁珠分离、梯度离心分离[7-8].每种方法各有优缺点:贴附细胞分离法，简单，易操作，但所得细胞的成分复杂，骨髓MSC的纯度有限;流式细胞仪、免疫磁珠分离，获得的MSCs纯度较高，但操作繁杂，需要昂贵的仪器和试剂，成本较高，并且对细胞的活性影响较大;梯度离心分离，操作方法简单，实验结果证明可取得较高纯度的MSCs. 目前对于骨髓间质干细胞的检测鉴定尚无特定的方法和特异性指标，应用较多的是采用AKP染色法[9].本实验各组培养所得的细胞，经AKP染色，均呈阴性，但各组之间尚存在一定差异，特别是经过加大培养过程中的更换培养液的频度，每天更换培养液，可使获得的MSCs的纯度进一步得到提高.
, http://www.100md.com
本实验采用Percoll梯度分离液行离心分离的方法，成体大鼠的骨髓MSCs分离后，经体外培养能大量增生，并形成细胞形态较为均一的细胞增生集落.骨髓 MSCs的培养生长曲线显示，MSCs在体外培养条件下生长与其他细胞一样经历了生长缓滞期、对数增生期和生长平稳期.从生长曲线可以看出，当细胞增生到一定程度，当细胞长满培养器皿的整个底部时，细胞的增生放慢，可能是细胞间的接触、生长空间缺乏所致.不同的更换培养液的频度对细胞的生长增生有不同的影响，每天更换培养液，细胞增生较快，生长良好，比目前国内外所报道的隔日或每3d更换培养液早2-3d达到细胞形态、大小均一和长满瓶底.其可能原因是，每日更换培养液，可尽早清除非帖壁细胞和生长较差贴壁不牢固的细胞，消除其对贴壁的基质干细胞生长增生的影响;每日更换培养液，可清除培养液中的不利于基质干细胞生长增生的某些物质，其进一步机制和原因有待于深入研究.
4 参考文献1 龚加庆,方驰华. 成人肝脏干细胞研究现状及展望.中华外科杂志 2002;40:385-387
, 百拇医药
2 Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD. Humanmesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte
phenotype in the adult murine heart.Circulation 2002;105:93-98
3 Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Limana F, Jakoniuk I, Quaini F,Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Mobilized
bone marrow cells repair the infarctedheart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci USA
, http://www.100md.com
2001;98:10344-10349
4 Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey PG. Bone marrow stromalstem cells: nature, biology, and potential
applications. Stem Cells 2001;19:180-192
5 马俊勋,方驰华. 卵圆细胞及其与原发性肝癌关系的研究进展.世界华人消化杂志 2002;10:448-451
6 张刚庆,卿三华, 齐德林.热疗联合丝裂霉素对大肠癌细胞的影响.中国胃肠外科杂志 1998;1:85-87
7 傅文玉,路艳蒙, 朴英杰.人骨髓间充质干细胞的培养及多能性研究.中华血液学杂志 2002;23:202-204
, 百拇医药
8 Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD,Ortiz-Gonzalez XR, Reyes M, Lenvik T, Lund T,Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A,Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM. Pluripotency of mesenchymalstem
cells derived from adult marrow. Nature 2002;418:41-49
9 Alison MR, Poulsom R, Jeffery R, Dhillon AP, Quaglia A, Jacob J,Novelli M, Prentice G, Williamson J, Wright NA.
Hepatocytes from non-hepatic adult stemcells. Nature 2000;406:257, http://www.100md.com( 张刚庆, 方驰华, 池达智)
