食管癌发生发展过程中RAR-b mRNA的原位表达
王立峰,王吾如,哈尔滨医科大学第一临床医学院病理科黑龙江省哈尔滨市 150001
张丽红,哈尔滨医科大学第一临床医学院放射科黑龙江省哈尔滨市 150001
刘明,哈尔滨医科大学第三临床医学院腹外科 黑龙江省哈尔滨市 150040
张伟,中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所,肿瘤生物检测中心北京市 100021
项目负责人:王立峰,150001, 黑龙江省哈尔滨市南岗区邮政街23号,哈尔滨医科大学第一临床医学院病理科. lfwy@public.hr.hl.cn
, 百拇医药
电话:0451-53604114
收稿日期:2004-04-22 接受日期:2004-06-10
摘要
目的:研究RAR-bmRNA在食管癌发生发展过程中的作用，探讨维A酸(RA，retinoidacid)在食管癌高危人群中化学预防和化学治疗中应用的可行性.
方法:应用原位杂交方法检测了食管癌70例(原位癌30例，鳞状细胞癌20例，腺癌20例)及增生性病变97例(单纯增生19例，不典型增生I-III分别为20例，39例，38例)和正常食管黏膜鳞状上皮组织19例中RAR-bmRNA表达情况.
结果:在正常食管黏膜上皮、单纯增生、不典型增生上皮总体及其I-III、原位癌、侵袭性鳞状细胞癌及腺癌中RAR-bmRNA表达的阳性率分别为100%(19/19)，94.7%(18/19)，90%(18/20)，69.2%(27/39)，68.4%(26/38)，63.3%(19/30)，60%(12/20)，60%(12/20).正常食管黏膜上皮较不典型增生总体、原位癌和侵袭癌组织均有显著性差异(P<0.05).
, 百拇医药
结论:RAR-bmRNA表达的丢失与食管癌的发生发展有关，用RA对表达RAR-b高危人群进行化学干预可能会得到预期效果.
王立峰,张丽红, 刘明,张伟, 王吾如.食管癌发生发展过程中RAR-bmRNA的原位表达.世界华人消化杂志 2004;12(8):1980-1982
0 引言RA(retinoid acid，维A酸)对食管癌细胞系的生长抑制和RAR-b(retinoid acid receptor beta, 维A酸b受体)的表达和表达上调有关，不表达RAR-b的细胞系对RA有抵抗力，可以在软琼脂糖中形成集落[1].为研究RAR-b在食管癌发展过程中表达的改变，以及应用RA在食管高危人群中进行化学预防的可行性，我们对205例一系列食管活检组织，包括正常食管黏膜、单纯增生、不典型增生食管上皮、原位癌和侵袭性癌组织中RAR-bmRNA的表达情况用非放射性原位杂交方法进行了研究.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 取自河北磁县1997年食管癌普查食管活检组织195例，经病理诊断:侵袭性鳞状细胞癌20例，原位癌30例，腺癌10例，不典型增生I，II，III级分别为20例，39例，38例，单纯增生19例和正常食管黏膜鳞状上皮19例.其中哈医大一院标本腺癌10例.地高辛配基核酸标记和检测试剂盒为Boehingermannheim公司产品.质粒PSG5(分别含RAR-b-antisensecDNA和RAR-b-sensecDNA，酶切位点分别为sphI和BamHI)，由中国医学科学院肿瘤研究所生物检测中心提供.BL21大肠杆菌由医科院基础所提供.
1.2 方法 探针的制备:重组质粒的转化、扩增、提取、纯化、酶切及酶切片段回收纯化参照“分子克隆”的方法进行，酶切电泳鉴定纯化质粒DNA及其酶切片段.探针的标记按试剂盒说明操作.杂交步骤按文献[2]方法进行，NBT/BCIP显色，用正义探针作阴性对照.结果分析采用计数资料的结构相对数(%)表示，统计学分析采用Fisher’s检验.
, 百拇医药
2 结果RAR-bmRNA阳性信号位于细胞质，NBT/BCIP染色为蓝紫色(图1，2).正常黏膜、单纯增生、不典型增生总体及其I，II，III级、原位癌、侵袭性鳞状细胞癌、腺癌的杂交阳性率分别为100%(19/19)，94.7%(18/19)，73.2%(71/97)，90%(18/20)，69.2%(27/39)，68.4%(26/38)，63.3%(19/30)，60%(12/20)，60%(12/20).正常黏膜、单纯增生的阳性信号普遍高于或相当于不典型增生和侵袭癌组织.
图1 RAR-bmRNA在食管不典型增生II中的阳性表达,紫蓝色颗粒定位于细胞浆×200.
图2 RAR-bmRNA在食管不典型增生III中的阳性表达,紫蓝色颗粒定位于细胞浆×200.
3 讨论维A酸及其衍生物对恶性与正常细胞的分化诱导和生长抑制起重要作用[3-6]，维A酸的这些功能是由维A酸受体所介导的，维A酸只有通过与其特异的核内受体结合才能发挥其生物学效应，因此对所研究组织中维A酸受体的检测将对肿瘤发生研究有很大意义.维A酸受体属于类固醇/甲状腺激素受体超家族，现已发现两大类受体可调节维A酸及其内源性和合成的化合物的生物学作用，即维A酸受体(RARs)和维A类X受体(RXRs)，都有三个亚基a,b和g.在动物实验和临床研究中，RAR-b的表达与恶性实体瘤的密切相关.
, 百拇医药
将RAR-b基因转染至表达RAR-b的肺上皮样癌肿细胞中，然后接种于裸鼠，该细胞的生长受抑制，不能形成肿瘤;而在表达反义RAR-b2的转基因鼠中，则可形成肺癌[7].在头颈部鳞状细胞癌中，RAR-b在邻近头颈部肿瘤正常组织和单纯增生表达率为70%，不典型增生为56%，恶性肿瘤为35%;RAR-a分别为94%，77%，70%;而RAR-g和RXR-a,b可在大部分头颈部肿瘤邻近正常组织、单纯增生、不典型增生和肿瘤中检测到[2];在乳腺癌中，RAR-b的表达率在邻近肿瘤正常组织为98.0%，导管原位癌83.1%，侵袭癌51.6%;RAR-a分别为98.1%，96.8%，83.6%;RAR-g分别为93%，88.5%，88.5%;而RXR-a分别为100%，100%，92%[8].即在恶性肿瘤中RAR-b基因较其他受体基因表达下降明显，故RAR-b表达的丢失与恶性实体瘤的关系较为密切.为研究RAR-b在食管癌发展过程中表达的改变，我们对205例一系列食管活检组织，包括正常食管黏膜、单纯增生、不典型增生食管上皮、原位癌和侵袭性癌组织中RAR-b基因的表达情况用非放射性原位杂交方法进行了研究.结果表明，RAR-b在正常组织中100%表达，不典型增生上皮中70%表达，60%的侵袭性鳞状细胞癌中表达阳性，其表达丢失率与文献报道的头颈癌、乳癌和非小细胞肺癌的研究结果相似[2,8-9]. 这说明RAR-bmRNA表达的丢失与食管癌的发生发展有关，我国是食管癌的高发区，用RA对表达RAR-b阳性高危人群进行化学干预可能会得到预期效果.
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虽然已经发现实体瘤的发生与RAR-b的表达丢失，但其内在的机制仍不清楚[10].我们知道RAR-a,RAR-b和RAR-g定位在17q21.1，3p24和12q13;RXR-a,b和g分别定位在9q34.3，6p21.3和1q22-23.然而定位于3p24的RAR-b，其3p的杂合性丢失仅在大约30%的食管癌检测到[11]，且与RAR-b的表达无关.我们知道RXRs和RARs在结合到DNA顺序前形成二聚体，这些二聚体与位于靶基因启动子的维A酸作用反应元件(RARE)结合，RARE以(A/G)GGTCA用2个或5个核苷酸间隔的重复为特征，从而调节靶基因的转录、表达，发挥其作用.因此在最近的研究中发现，全反式RAR诱导的bRARE转录活性的丢失才可能是RAR-b表达丢失的主要原因.但也可能有多重机制与RAR-b表达丢失有关, 有待进一步研究.
4 参考文献1 Xu XC, Liu X, Tahara E, Lippman SM, Lotan R. Expression andup-regulation of retinoic receptor-bis associated with
, 百拇医药
retinoid sensitivity and colony formationin esophageal cancer cell lines. Cancer Res 1999;59:2477-2483
2 Xu XC, Ro JY, Lee JS, Shin DM, Hong WK, Lotan R. Differentialexpression of nuclear retinoid receptors in
normal,premalignant, and malingnant headand neck tissues. Cancer Res 1994;54:3580-3587
3 Lotan R. Effects of vitamin A and its analogs(retinoids) on normaland neoplastic cells. Biochim Biophys Acta
, http://www.100md.com
1980;605:33-91
4 Moon RC, Mehta RG,Rao KVN. Retinoids and cancer in experimental animals.TheRetinoids-Biiology, Chemistry, and
Medicine, ed 2. New York, Raven Press, 1994:pp537-596
5 Inayama Y, Kitamura H, Shibagaki T, Usuda Y, Ito T, Nakatani Y,Kanisawa M. In vivo growth and differentiation potential
of tracheal basal cells of rabits invitamin A deficiency. Int J Exp Pathol 1996;77:89-97
, 百拇医药
6 Han J. Highlights of the cancer chemoprevention studies in China.Prev Med 1993;22:712-722
7 Berard J, Laboune F, Mukuna M, Masse S, Kothary R, Bradley WE. Lungtumors in mice expressing an antisense RAR-b2
transgene. FASEB J 1996;10:1091-1097
8 Xu XC, Sneige N, Lin X, Nandagiri R, Lee JJ, Lukmanji F, HortobagyiG, Lippman SM, Dhingra K, Lotan R. Progressive
, http://www.100md.com
decrease in nuclear retinoic acid receptor bmessenger RNA level during breast carcinogenesis. Cancer Res
1997;57:4992-4996
9 Xu XC, Sozzi G, Lee JS, Lee JJ, Pastorino U, Pilotti S, Kurie JM,Hong WK, Lotan R. Suppression of nuclear retinoic acid
receptor bin non-small-cell lung cancer in vivo: impliforications in lung cancerdevelopment. J Natl Cancer Inst
1997;89:624-629
10 de The H. Altered retinoicacid receptor. FASEB J 1996;10:955-960
11 Nakamura Y, Tokino T,Isomura M. Multistep carcinogenesis of esophageal carcinoma. MolecularPathology of
Gastroenterology Cancer. Edited by E Tahara.Tokoyo, Spring-Verlag, 1997:pp15-21, 百拇医药( 王立峰, 张丽红, 刘 明, 张 伟, 王吾如)
张丽红,哈尔滨医科大学第一临床医学院放射科黑龙江省哈尔滨市 150001
刘明,哈尔滨医科大学第三临床医学院腹外科 黑龙江省哈尔滨市 150040
张伟,中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所,肿瘤生物检测中心北京市 100021
项目负责人:王立峰,150001, 黑龙江省哈尔滨市南岗区邮政街23号,哈尔滨医科大学第一临床医学院病理科. lfwy@public.hr.hl.cn
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电话:0451-53604114
收稿日期:2004-04-22 接受日期:2004-06-10
摘要
目的:研究RAR-bmRNA在食管癌发生发展过程中的作用，探讨维A酸(RA，retinoidacid)在食管癌高危人群中化学预防和化学治疗中应用的可行性.
方法:应用原位杂交方法检测了食管癌70例(原位癌30例，鳞状细胞癌20例，腺癌20例)及增生性病变97例(单纯增生19例，不典型增生I-III分别为20例，39例，38例)和正常食管黏膜鳞状上皮组织19例中RAR-bmRNA表达情况.
结果:在正常食管黏膜上皮、单纯增生、不典型增生上皮总体及其I-III、原位癌、侵袭性鳞状细胞癌及腺癌中RAR-bmRNA表达的阳性率分别为100%(19/19)，94.7%(18/19)，90%(18/20)，69.2%(27/39)，68.4%(26/38)，63.3%(19/30)，60%(12/20)，60%(12/20).正常食管黏膜上皮较不典型增生总体、原位癌和侵袭癌组织均有显著性差异(P<0.05).
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结论:RAR-bmRNA表达的丢失与食管癌的发生发展有关，用RA对表达RAR-b高危人群进行化学干预可能会得到预期效果.
王立峰,张丽红, 刘明,张伟, 王吾如.食管癌发生发展过程中RAR-bmRNA的原位表达.世界华人消化杂志 2004;12(8):1980-1982
0 引言RA(retinoid acid，维A酸)对食管癌细胞系的生长抑制和RAR-b(retinoid acid receptor beta, 维A酸b受体)的表达和表达上调有关，不表达RAR-b的细胞系对RA有抵抗力，可以在软琼脂糖中形成集落[1].为研究RAR-b在食管癌发展过程中表达的改变，以及应用RA在食管高危人群中进行化学预防的可行性，我们对205例一系列食管活检组织，包括正常食管黏膜、单纯增生、不典型增生食管上皮、原位癌和侵袭性癌组织中RAR-bmRNA的表达情况用非放射性原位杂交方法进行了研究.
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1 材料和方法
1.1 材料 取自河北磁县1997年食管癌普查食管活检组织195例，经病理诊断:侵袭性鳞状细胞癌20例，原位癌30例，腺癌10例，不典型增生I，II，III级分别为20例，39例，38例，单纯增生19例和正常食管黏膜鳞状上皮19例.其中哈医大一院标本腺癌10例.地高辛配基核酸标记和检测试剂盒为Boehingermannheim公司产品.质粒PSG5(分别含RAR-b-antisensecDNA和RAR-b-sensecDNA，酶切位点分别为sphI和BamHI)，由中国医学科学院肿瘤研究所生物检测中心提供.BL21大肠杆菌由医科院基础所提供.
1.2 方法 探针的制备:重组质粒的转化、扩增、提取、纯化、酶切及酶切片段回收纯化参照“分子克隆”的方法进行，酶切电泳鉴定纯化质粒DNA及其酶切片段.探针的标记按试剂盒说明操作.杂交步骤按文献[2]方法进行，NBT/BCIP显色，用正义探针作阴性对照.结果分析采用计数资料的结构相对数(%)表示，统计学分析采用Fisher’s检验.
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2 结果RAR-bmRNA阳性信号位于细胞质，NBT/BCIP染色为蓝紫色(图1，2).正常黏膜、单纯增生、不典型增生总体及其I，II，III级、原位癌、侵袭性鳞状细胞癌、腺癌的杂交阳性率分别为100%(19/19)，94.7%(18/19)，73.2%(71/97)，90%(18/20)，69.2%(27/39)，68.4%(26/38)，63.3%(19/30)，60%(12/20)，60%(12/20).正常黏膜、单纯增生的阳性信号普遍高于或相当于不典型增生和侵袭癌组织.
图1 RAR-bmRNA在食管不典型增生II中的阳性表达,紫蓝色颗粒定位于细胞浆×200.
图2 RAR-bmRNA在食管不典型增生III中的阳性表达,紫蓝色颗粒定位于细胞浆×200.
3 讨论维A酸及其衍生物对恶性与正常细胞的分化诱导和生长抑制起重要作用[3-6]，维A酸的这些功能是由维A酸受体所介导的，维A酸只有通过与其特异的核内受体结合才能发挥其生物学效应，因此对所研究组织中维A酸受体的检测将对肿瘤发生研究有很大意义.维A酸受体属于类固醇/甲状腺激素受体超家族，现已发现两大类受体可调节维A酸及其内源性和合成的化合物的生物学作用，即维A酸受体(RARs)和维A类X受体(RXRs)，都有三个亚基a,b和g.在动物实验和临床研究中，RAR-b的表达与恶性实体瘤的密切相关.
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将RAR-b基因转染至表达RAR-b的肺上皮样癌肿细胞中，然后接种于裸鼠，该细胞的生长受抑制，不能形成肿瘤;而在表达反义RAR-b2的转基因鼠中，则可形成肺癌[7].在头颈部鳞状细胞癌中，RAR-b在邻近头颈部肿瘤正常组织和单纯增生表达率为70%，不典型增生为56%，恶性肿瘤为35%;RAR-a分别为94%，77%，70%;而RAR-g和RXR-a,b可在大部分头颈部肿瘤邻近正常组织、单纯增生、不典型增生和肿瘤中检测到[2];在乳腺癌中，RAR-b的表达率在邻近肿瘤正常组织为98.0%，导管原位癌83.1%，侵袭癌51.6%;RAR-a分别为98.1%，96.8%，83.6%;RAR-g分别为93%，88.5%，88.5%;而RXR-a分别为100%，100%，92%[8].即在恶性肿瘤中RAR-b基因较其他受体基因表达下降明显，故RAR-b表达的丢失与恶性实体瘤的关系较为密切.为研究RAR-b在食管癌发展过程中表达的改变，我们对205例一系列食管活检组织，包括正常食管黏膜、单纯增生、不典型增生食管上皮、原位癌和侵袭性癌组织中RAR-b基因的表达情况用非放射性原位杂交方法进行了研究.结果表明，RAR-b在正常组织中100%表达，不典型增生上皮中70%表达，60%的侵袭性鳞状细胞癌中表达阳性，其表达丢失率与文献报道的头颈癌、乳癌和非小细胞肺癌的研究结果相似[2,8-9]. 这说明RAR-bmRNA表达的丢失与食管癌的发生发展有关，我国是食管癌的高发区，用RA对表达RAR-b阳性高危人群进行化学干预可能会得到预期效果.
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虽然已经发现实体瘤的发生与RAR-b的表达丢失，但其内在的机制仍不清楚[10].我们知道RAR-a,RAR-b和RAR-g定位在17q21.1，3p24和12q13;RXR-a,b和g分别定位在9q34.3，6p21.3和1q22-23.然而定位于3p24的RAR-b，其3p的杂合性丢失仅在大约30%的食管癌检测到[11]，且与RAR-b的表达无关.我们知道RXRs和RARs在结合到DNA顺序前形成二聚体，这些二聚体与位于靶基因启动子的维A酸作用反应元件(RARE)结合，RARE以(A/G)GGTCA用2个或5个核苷酸间隔的重复为特征，从而调节靶基因的转录、表达，发挥其作用.因此在最近的研究中发现，全反式RAR诱导的bRARE转录活性的丢失才可能是RAR-b表达丢失的主要原因.但也可能有多重机制与RAR-b表达丢失有关, 有待进一步研究.
4 参考文献1 Xu XC, Liu X, Tahara E, Lippman SM, Lotan R. Expression andup-regulation of retinoic receptor-bis associated with
, 百拇医药
retinoid sensitivity and colony formationin esophageal cancer cell lines. Cancer Res 1999;59:2477-2483
2 Xu XC, Ro JY, Lee JS, Shin DM, Hong WK, Lotan R. Differentialexpression of nuclear retinoid receptors in
normal,premalignant, and malingnant headand neck tissues. Cancer Res 1994;54:3580-3587
3 Lotan R. Effects of vitamin A and its analogs(retinoids) on normaland neoplastic cells. Biochim Biophys Acta
, http://www.100md.com
1980;605:33-91
4 Moon RC, Mehta RG,Rao KVN. Retinoids and cancer in experimental animals.TheRetinoids-Biiology, Chemistry, and
Medicine, ed 2. New York, Raven Press, 1994:pp537-596
5 Inayama Y, Kitamura H, Shibagaki T, Usuda Y, Ito T, Nakatani Y,Kanisawa M. In vivo growth and differentiation potential
of tracheal basal cells of rabits invitamin A deficiency. Int J Exp Pathol 1996;77:89-97
, 百拇医药
6 Han J. Highlights of the cancer chemoprevention studies in China.Prev Med 1993;22:712-722
7 Berard J, Laboune F, Mukuna M, Masse S, Kothary R, Bradley WE. Lungtumors in mice expressing an antisense RAR-b2
transgene. FASEB J 1996;10:1091-1097
8 Xu XC, Sneige N, Lin X, Nandagiri R, Lee JJ, Lukmanji F, HortobagyiG, Lippman SM, Dhingra K, Lotan R. Progressive
, http://www.100md.com
decrease in nuclear retinoic acid receptor bmessenger RNA level during breast carcinogenesis. Cancer Res
1997;57:4992-4996
9 Xu XC, Sozzi G, Lee JS, Lee JJ, Pastorino U, Pilotti S, Kurie JM,Hong WK, Lotan R. Suppression of nuclear retinoic acid
receptor bin non-small-cell lung cancer in vivo: impliforications in lung cancerdevelopment. J Natl Cancer Inst
1997;89:624-629
10 de The H. Altered retinoicacid receptor. FASEB J 1996;10:955-960
11 Nakamura Y, Tokino T,Isomura M. Multistep carcinogenesis of esophageal carcinoma. MolecularPathology of
Gastroenterology Cancer. Edited by E Tahara.Tokoyo, Spring-Verlag, 1997:pp15-21, 百拇医药( 王立峰, 张丽红, 刘 明, 张 伟, 王吾如)
