白莉,毛高平, 张映辉,曹传平,中国人民解放军空军总医院消化内科 北京市 100036
项目负责人:白莉, 100036, 北京市海淀区阜成路30号,中国人民解放军空军总医院消化内科. bai_li@hotmail.com
电话:010-66928046
收稿日期:2004-10-15 接受日期:2004-11-04
摘要
目的:探讨肝癌手术切除后机体凝血活性的改变对肿瘤复发和转移的影响.
方法:切除正常成年615小鼠部分肝脏，24h后取血测凝血活性. 在部分肝切除(PH)的动物同时给予脾接种转移性肝瘤细胞，在手术前后给予纤溶酶抗凝治疗，饲养动物11d后分析肿瘤转移程度.
结果:单纯PH组术后血小板聚集(PLT)和纤维蛋白原(Fbg)含量明显增加(P= 0.018 <0.05，P= 0.012 <0.05)，提示凝血活性显著增高;由于凝血因子消耗,部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)显著延长(P= 0.007 <0.01，P= 0.0019 <0.01). 在给予PH组动物纤溶酶处理后,除PT外，几乎全部恢复到手术前水平(P> 0.05). 手术+抗凝治疗组肿瘤转移程度较单纯手术组有明显减少(P= 0.003 <0.01).
结论:PH后机体高凝状态与术后肿瘤转移增强可能有明显相关性.
白莉,毛高平, 张映辉,曹传平. 肝癌切除术后高凝状态对肿瘤转移的影响.世界华人消化杂志 2004;12(12):2891-2893
0 引言文献报道，肝癌切除后2-3a内复发多为原发灶播散
[1-2]，复发的因素主要与术前肿瘤的生物学特性包括肿瘤的大小、瘤结节的数目、门静脉癌栓、术后机体的免疫状态、原有肝脏病变情况如肝炎和肝硬化的状态有关.手术本身诱发血液高凝状态有助于循环血中的瘤细胞附着在血管内皮，在其他因素的参与下穿透血管壁进入组织形成转移病灶，这些瘤细胞来源于原发病灶的脱落和医源性如手术挤压瘤体.手术因素造成肝癌复发出现在较早期，因此与外科治疗的成败密切相关.我们针对手术后血液高凝状态对肝癌术后转移的影响进一步分析.
1 材料和方法
1.1 材料 615小鼠，18-22g，雌雄各半，共32只，购自预防医学科学院实验动物中心.615小鼠H
22肝癌腹水瘤细胞购自中国医学科学院病理系.纤溶酶由航空医学研究所馈赠.
1.2 方法
1.2.1 部分肝切除(PH)动物模型 将实验动物分为PH组、PH+纤溶酶治疗组和非PH对照组.PH组动物在乙醚麻醉下腹部正中行纵形切口，取鼠肝右叶切除占全肝重量的25%的肝组织，局部压迫止血后关腹.在术后24 h用乙醚麻醉后开腹经下腔静脉取血，立即按照1∶9比例与含枸橼酸钠的抗凝剂充分混合.
1.2.2 肝转移动物模型及抗凝治疗 小鼠随机分为PH组、PH+纤溶酶治疗组和对照组.同上方法切除占全肝1/3体积肝脏，取活体615小鼠H
22肝癌腹水瘤细胞1×10
6脾包膜下注射，动物被饲养11d后断颈处死，取肝脏进行转移集落计数.治疗组每只动物给予纤溶酶0.1mg (1 g/L，航空医学研究所)尾静脉注射，隔日给药一次，术前及术后各两次.
1.2.3 凝血活性指标 凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fbg)、部分凝血活酶时间(APTT)和血小板聚集(PLT)采用临床常规方法检测.PH组、PH+纤溶酶治疗组和对照组动物分别为10、12和10只.所有检测均重复三次.
1.2.4 转移瘤定级标准 参照高进制定的标准稍加改进
[14].0级: 无转移.Ⅰ级: 在肝的一个叶内有1-2个小转移灶，直径0.2-0.5mm. Ⅱ级: 肝内有3-5个小转移灶或1-2个较大转移灶，直径0.5-1mm. Ⅲ级: 肝内转移灶>1mm，但<1 cm，或小转移灶数目较多，未波及全肝者.Ⅳ级: 肝内肿块>1 cm，或弥散性病灶波及全肝者.本研究中所计数的肝转移灶均为肝表面肉眼所见的病灶.
统计学处理 各组计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS统计软件进行组间显著性分析和非参数对比分析.
2 结果
2.1 PH动物手术前、后凝血活性测定结果 PH后24 h采集静脉血测定APTT、Fgb、PT和PLT(图1).经t检验学分析，PH组的实验动物体内凝血活性在术后24h已发生明显的变化.与非PH对照组比较，单纯PH组显示术后PLT和Fbg含量明显增加(P= 0.018 <0.05，P= 0.012 <0.05)，提示凝血活性显著增高;由于凝血因子的消耗，反映内源性凝血系统活性的APTT和外源性凝血系统活性的PT显示明显延长(P= 0.007 <0.01，P= 0.0 019 <0.01). 在给予PH组动物纤溶酶处理后，除PT外，几乎全部恢复到手术前水平(P>0.05)(图1).
图1(PDF)手术组与手术+抗凝治疗组动物凝血活性测定结果.
2.2 抗凝治疗对术后肝癌转移的影响 PH同时脾接种瘤细胞，在术后11d杀鼠，留取肝脏进行肿瘤转移分析，结果如表1.
经SPSS的非参数统计分析，治疗组肿瘤转移程度较对照组有显著性差异(P= 0.003 <0.01，表1).
表1 PH同时抗凝治疗后肝内肿瘤转移病灶分析
| 组别 | n | 肿瘤分期 |
| 0 | I | II | III | IV |
| 对照组 | 40 | 0 | 0 | 3 | 21 | 16 |
| 治疗组 | 38 | 0 | 3 | 4 | 27 | 4 |
3 讨论凝血功能异常是某些恶性肿瘤的基本特征，如乳腺癌、原发性肝癌等患者均存在血液高凝状态.根据统计，约有60%以上的恶性肿瘤患者出血时间缩短，部分凝血因子增高.在晚期肿瘤患者中，纤维蛋白原含量增高，血小板寿命缩短.一方面，肿瘤细胞可激活血小板和纤维蛋白原引起机体凝血功能障碍，出现血栓形成、出血、甚至弥漫性血管内凝血.另一方面，肿瘤细胞、血小板和纤维蛋白三者形成瘤栓，这有助于肿瘤细胞躲避机体免疫系统的识别而发生浸润、生长和转移.因此，异常凝血机制是促恶性肿瘤转移的关键因素之一.尹格平etal
[4]发现老年癌症患者手术后血小板P-选择素(CD62P)及血小板反应蛋白(thrombospondin，一种可接受促分裂原刺激的钙结合糖蛋白，对血栓块具有稳定作用，主要见于血小板的a颗粒)在男性患者较术前分别升高了10.41和5.09倍，女性升高了2.47和2.01倍.
手术能导致机体凝血活性增高.肝部分切除术后，凝血活性明显增强在文献中已有报道，如Skurzaket al检测10名健康供肝者在部分肝切除后机体血凝状态时发现，术后第5和第10d分别有4和6例供肝者出现血液高凝状态，1例在第8d出现深静脉血栓
[15].不仅肝脏手术可引起机体凝血活性明显增强，腹部大手术的患者手术后也出现高凝状态，原因与血小板反应性增加有关
[3].我们的实验提示PH术后动物体内凝血系统活性明显增强，瘤细胞在术后48-72h就发现有附着于血管壁，故从形态学上证实，肿瘤细胞的黏附、着床、转移与凝血活性显著增高有关.不仅如此，由于手术创伤可造成内皮细胞的损伤，使血小板和凝血酶活化，纤维蛋白原及纤维蛋白含量增加，所以外科手术后极易于在微血管内形血栓.此外，小血管的损伤造成涡流形成，也有助于肿瘤细胞的滞留和黏附.在手术或非手术因素诱发的严重感染的情况下，血管内皮细胞损伤脱落、胶原组织暴露，血小板与之发生黏附、聚集和释放反应，其释放的产物可使血小板进一步聚集形成大量血小板微血栓，有利于血小板、纤维蛋白和瘤细胞三体复合物的形成，为肿瘤细胞的着床提供有利条件.就凝血酶本身来说，对肿瘤转移的作用是通过骨桥蛋白(Osteopontin，OPN，一种唾液酸蛋白，可与细胞结合充当细胞与细胞外基质之间的桥梁)而实现的
[9].肿瘤细胞可合成OPN，他具有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的结构，是细胞黏附的位点，通过与整合素(avb3)结合介导细胞的黏附和游走
[5-6].凝血酶除了能强烈诱导血小板聚集外，又是一种强烈的促分裂剂.他还可诱导细胞表面整合素aⅡbb3的表达，从而促使肿瘤细胞黏附于内皮细胞和间质蛋白上
[7].
吴孟超etal发现临床肝切除术后复发早者可在术后2mo内，高峰期为术后1-2a，而术后5 a以上复发的病例较少
[13].关于术后复发的原因多数人认为这是由于原有在残余肝脏内的微卫星病灶迅速生长的原因.但肝移植术后的肝癌复发提示，残留在血流中的肿瘤细胞因其嗜肝性可能重新种植在肝脏.据文献报道，术前肿瘤的大小、有无血管受侵或癌栓、血中甲胎蛋白(AFP)的水平等均与移植后的复发有关
[10-12].肿瘤的负荷愈大，进入血循环中瘤细胞的比例愈大.因此，尽管肝移植后，已将病变的肝脏摘除，肝癌复发的原因可考虑为，脱落进入或移植手术过程中挤压进入血流中的癌细胞在手术创伤诱发的炎性因子和生长因子的刺激下迅速生长，成为复发病灶的来源
[8];大量应用免疫抑制剂削弱了机体自我识辨能力也是其中的原因之一.此时，肝脏血流动力学的改变有助于残留在血液中的瘤细胞滞留、着床.在严重感染的情况下，内皮细胞损伤脱落，胶原组织暴露，血小板黏附、聚集，释放出腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、儿茶酚胺和5-羟色胺等产物使血小板进一步聚集，形成大量血小板微血栓，沉着于微循环.血小板被激活后，通过花生四烯酸形成过氧化物前列腺素G2(PGG2)、前列腺素H2(PGH2)、血栓烷A2(TXA2)等前列腺素产物，他们不仅可促进血小板聚集，还可使小血管收缩.内毒素在IL-1、TNF、血小板活化(PAF)等介导下损伤内皮细胞，有助于在此形成微血栓.目前认为，血小板与肿瘤细胞间具有黏附作用，机制可能为:肿瘤细胞和血小板表面的糖分子之间具有相互作用;肿瘤细胞和血小板有广泛的植物血凝素(lectin)的表达;高转移的肿瘤细胞能表达各种异常的内源性lectin或含涎酸的糖结合位点.肿瘤细胞上的涎酸化糖蛋白结合点能识别血小板上的糖配体lectin分子.所以，在肝脏肿瘤被切除之后，或肝癌患者接受肝移植后出现的转移有各种因素的影响，但血流动力学的改变，尤其是血液高凝状态和术后的损伤因素是不能忽视的促转移因素之一.
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( 白 莉, 毛高平, 张映辉, 曹传平)
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