高效毛细管电泳分离氨基酸对肝癌肝硬化的诊断价值
王跃国,王惠民, 鞠少卿, 王忠慧, 宋红伟, 李丽,江苏省南通大学附属医院检验医学中心 江苏省南通市 226001
项目负责人:王跃国,226001,江苏省南通市西寺路20号,江苏省南通大学附属医院检验医学中心. jsq814@hotmail.com
电话:0513-5052103 传真: 0513-5052102
收稿日期:2004-11-09 接受日期: 2004-12-08
摘要
目的:建立高效毛细管电泳分离氨基酸的方法探讨肝癌肝硬化患者血清氨基酸变化.
, 百拇医药
方法:用毛细管电泳法对17种常见氨基酸的2，4-二硝基氟苯(DNFB)衍生物进行了分离研究，优化缓冲液浓度、pH、有机溶剂及表面活性剂对分离影响的条件，对正常人，肝癌及肝硬化患者各20例的血浆游离氨基酸进行测定.
结果:在优化条件下，17种氨基酸除亮氨酸，异亮氨酸外均达到基线分离.9min内分离18种氨基酸，线性在20-1000 mmol/L范围，回收率为77.5-113.3%，批内精密度2.6-11.4%，批间精密度5.8-19.7%.肝硬化组酪氨酸、丝氨酸、色氨酸明显升高，丙氨酸明显下降;肝癌组酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸明显升高，脯氨酸明显下降.
结论:以浓度为30mmol/L pH9.9的硼砂溶液含150g/L异丙醇为运行缓冲液，分离氨基酸DNFB衍生物效果最佳，分离时间30min，出峰17个.毛细管电泳测定血浆游离氨基酸对肝癌肝硬化诊断和治疗有一定指导意义.
, 百拇医药
王跃国,王惠民, 鞠少卿,王忠慧,宋红伟, 李丽.高效毛细管电泳分离氨基酸对肝癌肝硬化的诊断价值.世界华人消化杂志 2005;13(3):406-408
(PDF)异丙醇对分离的影响. 1: 酪氨酸Tyr; 2: 组氨酸His; 3:赖氨酸Lys; 4: 丝氨酸Ser; 5: 色氨酸Trp; 6: 半胱氨酸Cys; 7:苯丙氨酸Phe; 8: 亮氨酸Leu; 9: 异亮氨酸Ile; 10: 谷氨酰胺Gln;11: 甲硫氨酸Met; 12: 缬氨酸Val; 13: 苏氨酸Thr; 14: 天冬酰胺Asn;15: 脯氨酸Pro; 16: 丙氨酸Ala; 17: 甘氨酸Gly.
图2 (PDF) 氨基酸标准混合液电泳图谱.1: Try; 2: His; 3: Lys; 4: Ser; 5: Cys; 6: Tyr; 7: Phe+Ile+Leu; 8: Met+Gln;9: Val; 10: Thr; 11: Asn; 12: Pro; 13: Ser; 14: Ala; 15:Gly.
, http://www.100md.com
取一份正常人血清标本，进行批内和批间精密度测定.批内精密度测定时，同一份样本同时测12次，作为批内精密度观察指标，其变异系数为2.6-11.4%;批间精密度测定时，每天测1次，共6d，作为批间精密度观察指标，其变异系数为5.8-19.7%.将20种氨基酸标准液稀释成20，30，50，100，200，400，500，800和1 000 mmol/L几个不同浓度，测定后进行线性回归，其相关系数r= 0.938-0.954.表明18种氨基酸在20-1000 mmol/L范围内线性良好.人血清标本经乙腈去蛋白衍生化反应后，直接进样分析.可知，血清中其他成分对所要测定的氨基酸无明显的干扰.取一份正常人血清标本，分别加入40mmol/L和360 mmol/L两种浓度的氨基酸标准液，测得平均回收率为95.4%.对20名健康人血清中12种游离氨基酸进行参考值调查，其中男性11例，年龄18-45岁;女性9例，年龄18-42岁.血清氨基酸含量见表1.结果采用t检验进行统计学处理，发现肝硬化组酪氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸明显升高，丙氨酸明显下降;肝癌组酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺明显升高，脯氨酸明显下降(P<0.05).
, 百拇医药
表1 肝癌肝硬化患者12种血清氨基酸测定结果(meanSD，mmol/L，n= 20)
, 百拇医药
aP<0.05vs正常人.
3 讨论
氨基酸传统分析方法为离子交换色谱法和反相高效液相色谱法，这些方法操作繁琐，成本高费时.高效毛细管电泳法是近几年发展起来的新技术，其分离效能高快速且试剂消耗低.Shenet al[8] 成功分离了16种DNFB衍生的氨基酸标准品并用此条件定量血清中16种氨基酸的含量.但组成人体蛋白质的氨基酸有20种，仅分离16种不能用于血清游离氨基酸定量.我们用20种氨基酸标准品，衍生物同样为DNFB.从缓冲液浓度，pH，添加剂等几个方面观察其对氨基酸分离的影响，pH>9的缓冲溶液分离氨基酸较容易，硼砂是此范围中最常用的缓冲溶液，我们比较了硼砂缓冲溶液与硼酸钠缓冲液[8]作为衍生缓冲液发现前者效果好，不使用添加剂情况下增加一个峰，但硼砂溶液溶解度低，可选浓度范围较小，随着缓冲液浓度增加，电流的增加，焦耳热增多，管内形成温度梯度，影响分离结果;相同的pH条件下，从分离和峰形综合考虑，本实验选择30mmol/L硼砂作运行缓冲液.pH对结果影响较大，在pH9.3-10.1的范围，分离效果逐渐改善，到pH9.9时变化较明显.我们选择了一些有机溶剂和表面活性剂，除150g/L异丙醇，分离效果未见改善.因此，用30 mmol/LpH9.9的硼砂溶液，150 g/L异丙醇作添加剂可成功分离17种氨基酸，缬氨酸和三种芳香族氨基酸基线分离，亮氨酸、异亮氨酸与其他成分基线分离，可准确定量15种氨基酸和支芳比，基本满足临床需要.用18种氨基酸标准液进行电泳，其中12种氨基酸可达到完全分离，得到15个峰，苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺无法单独分离，另外，丝氨酸出现两个峰.我们采用的2，4-二硝基氟苯，最初被用来进行氨基酸的测序，该法稳定、摩尔吸光系数大，且能与二级氨基反应，其不足之处是与谷氨酸的衍生化反应较慢[8]，且衍生化反应容易使样品受到污染.鉴于此，人们一直在寻找无需衍生、简易的氨基酸分析方法.作为经典的判断肝病氨基酸代谢异常的指标，血清支链氨基酸与芳香氨基酸之比(BCAA/AAA)已被广泛应用.肝病时血浆氨基酸变化主要表现为支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸又称BCAA)降低，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸又称AAA)升高，支/芳比降低[9-10].在我们的研究中，支持这一结论.在肝硬化组丙氨酸明显下降;肝癌组苏氨酸明显升高，脯氨酸明显下降，缬氨酸有代偿性升高.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Ninomiya T, Yoon S, Sugano M, Kumon Y, Seo Y, Shimizu K, Nagano H, Kasuga M, Hayashi Y. Improvement of molar
ratio of branched-chain amino acids to tyrosine(BTR)associated with liver fibrosis in chronic hepatitis C patients
treated with interferon-alpha. Dig Dis Sci 1999;44:1027-1033
2 Suzuki H, Mamata Y, Mizuno H, Tominaga T, Suga M, Suemori S, Sato A, Suzuki M. Influence of alcohol on
, http://www.100md.com
branched-chain amino acid/tyrosine molar ratio in patients with cirrhosis. Alcohol Clini Exp Res
1998;22(3 Suppl):137S-140S
3 Marchesini G, Bianchi G, Rossi B, Brizi M, Melchionda N. Nutritional treatment with branched-chain amino acids in
advanced liver cirrhosis. J Gastroenterol 2000;35(Suppl 12):7-12
4 Kawamura-Yasui N, Kaito M, Nakagawa N, Fujita N, Ikoma J, Gabazza EC, Watanabe S, Adachi Y. Evaluating response
, http://www.100md.com
to nutritional therapy using the branched-chain amino acid/tyrosine ratio in patients with chronic liver disease.
J Clin Lab Anal 1999;13:31-34
5 Barbul A. Arginine:biochemistry, physiology, and therapeutic implications.(review No abstract).
J Parenter Enteral Nutr 1986;10:227-238
6 Yu M, Dovichi NJ. Attomole amino acid determination by capillary zone electrophoresis with thermooptical
, http://www.100md.com
absorbance detection. Anal Chem 1989;61:37-40
7 Kuhr WG, Yeung ES. Indirect fluorescence detection of native amino acids in capillary zone electrophoresis.
Anal Chem 1988;60:1832-1834
8 She Z, Sun Z, Wu L, Wu K, Sun S, Huang Z. Rapid method for the determination of amino acids in serum by
capillary electrophoresis. J Chromatogr A 2002;979:227-232
, 百拇医药
9 沈同, 王镜岩, 赵邦悌. 生物化学. 第二版. 北京:高等教育出版社, 1990:116-117
10 Kano T, Nagaki M, Takahashi T, Ohnishi H, Saitoh K, Kimura K, Muto Y. Plasma free amino acid pattern in
chronic hepatitis as a sensitive and prognostic index. Gastroenterol Jpn 1991;26:344-349
编辑 张海宁, http://www.100md.com( 王跃国, 王惠民, 鞠少卿, 王忠慧, 宋红伟, 李 丽)
项目负责人:王跃国,226001,江苏省南通市西寺路20号,江苏省南通大学附属医院检验医学中心. jsq814@hotmail.com
电话:0513-5052103 传真: 0513-5052102
收稿日期:2004-11-09 接受日期: 2004-12-08
摘要
目的:建立高效毛细管电泳分离氨基酸的方法探讨肝癌肝硬化患者血清氨基酸变化.
, 百拇医药
方法:用毛细管电泳法对17种常见氨基酸的2，4-二硝基氟苯(DNFB)衍生物进行了分离研究，优化缓冲液浓度、pH、有机溶剂及表面活性剂对分离影响的条件，对正常人，肝癌及肝硬化患者各20例的血浆游离氨基酸进行测定.
结果:在优化条件下，17种氨基酸除亮氨酸，异亮氨酸外均达到基线分离.9min内分离18种氨基酸，线性在20-1000 mmol/L范围，回收率为77.5-113.3%，批内精密度2.6-11.4%，批间精密度5.8-19.7%.肝硬化组酪氨酸、丝氨酸、色氨酸明显升高，丙氨酸明显下降;肝癌组酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸明显升高，脯氨酸明显下降.
结论:以浓度为30mmol/L pH9.9的硼砂溶液含150g/L异丙醇为运行缓冲液，分离氨基酸DNFB衍生物效果最佳，分离时间30min，出峰17个.毛细管电泳测定血浆游离氨基酸对肝癌肝硬化诊断和治疗有一定指导意义.
, 百拇医药
王跃国,王惠民, 鞠少卿,王忠慧,宋红伟, 李丽.高效毛细管电泳分离氨基酸对肝癌肝硬化的诊断价值.世界华人消化杂志 2005;13(3):406-408
(PDF)异丙醇对分离的影响. 1: 酪氨酸Tyr; 2: 组氨酸His; 3:赖氨酸Lys; 4: 丝氨酸Ser; 5: 色氨酸Trp; 6: 半胱氨酸Cys; 7:苯丙氨酸Phe; 8: 亮氨酸Leu; 9: 异亮氨酸Ile; 10: 谷氨酰胺Gln;11: 甲硫氨酸Met; 12: 缬氨酸Val; 13: 苏氨酸Thr; 14: 天冬酰胺Asn;15: 脯氨酸Pro; 16: 丙氨酸Ala; 17: 甘氨酸Gly.
图2 (PDF) 氨基酸标准混合液电泳图谱.1: Try; 2: His; 3: Lys; 4: Ser; 5: Cys; 6: Tyr; 7: Phe+Ile+Leu; 8: Met+Gln;9: Val; 10: Thr; 11: Asn; 12: Pro; 13: Ser; 14: Ala; 15:Gly.
, http://www.100md.com
取一份正常人血清标本，进行批内和批间精密度测定.批内精密度测定时，同一份样本同时测12次，作为批内精密度观察指标，其变异系数为2.6-11.4%;批间精密度测定时，每天测1次，共6d，作为批间精密度观察指标，其变异系数为5.8-19.7%.将20种氨基酸标准液稀释成20，30，50，100，200，400，500，800和1 000 mmol/L几个不同浓度，测定后进行线性回归，其相关系数r= 0.938-0.954.表明18种氨基酸在20-1000 mmol/L范围内线性良好.人血清标本经乙腈去蛋白衍生化反应后，直接进样分析.可知，血清中其他成分对所要测定的氨基酸无明显的干扰.取一份正常人血清标本，分别加入40mmol/L和360 mmol/L两种浓度的氨基酸标准液，测得平均回收率为95.4%.对20名健康人血清中12种游离氨基酸进行参考值调查，其中男性11例，年龄18-45岁;女性9例，年龄18-42岁.血清氨基酸含量见表1.结果采用t检验进行统计学处理，发现肝硬化组酪氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸明显升高，丙氨酸明显下降;肝癌组酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺明显升高，脯氨酸明显下降(P<0.05).
, 百拇医药
表1 肝癌肝硬化患者12种血清氨基酸测定结果(meanSD，mmol/L，n= 20)
| 氨基酸 | 正常人 | 肝硬化 | 肝癌 |
| 酪氨酸 | 30.8±8.6 | 67.4±40.5a | 56.8±23.0a |
| 组氨酸 | 48.2±11.8 | 54.2±27.3 | 49.2±16.6 |
| 赖氨酸 | 97.6±30.2 | 97.8±28.2 | 127.0±40.1a |
| 丝氨酸 | 111.0±35.6 | 130.2±31.5a | 136.2±39.5 |
| 半胱氨酸 | 161.4±54.0 | 149.6±67.8 | 208.0±304.0 |
| 色氨酸 | 17.8±8.6 | 33.6±20.8a | 45.8±14.2a |
| 缬氨酸 | 137.2±41.4 | 138.0±31.4 | 187.6±32.3a |
| 苏氨酸 | 98.0±29.2 | 110.0±41.6 | 115.6±31.7a |
| 天冬酰胺 | 34.6±13.5 | 55.2±22.2a | 51.8±22.6a |
| 脯氨酸 | 121.4±47.1 | 126.8±54.8 | 105.6±30.8a |
| 丙氨酸 | 227.4±67.8 | 160.4±57.0a | 206.8±48.9 |
| 甘氨酸 | 216.6±67.8 | 228.4±80.3 | 212.0±38.2 |
, 百拇医药
aP<0.05vs正常人.
3 讨论
氨基酸传统分析方法为离子交换色谱法和反相高效液相色谱法，这些方法操作繁琐，成本高费时.高效毛细管电泳法是近几年发展起来的新技术，其分离效能高快速且试剂消耗低.Shenet al[8] 成功分离了16种DNFB衍生的氨基酸标准品并用此条件定量血清中16种氨基酸的含量.但组成人体蛋白质的氨基酸有20种，仅分离16种不能用于血清游离氨基酸定量.我们用20种氨基酸标准品，衍生物同样为DNFB.从缓冲液浓度，pH，添加剂等几个方面观察其对氨基酸分离的影响，pH>9的缓冲溶液分离氨基酸较容易，硼砂是此范围中最常用的缓冲溶液，我们比较了硼砂缓冲溶液与硼酸钠缓冲液[8]作为衍生缓冲液发现前者效果好，不使用添加剂情况下增加一个峰，但硼砂溶液溶解度低，可选浓度范围较小，随着缓冲液浓度增加，电流的增加，焦耳热增多，管内形成温度梯度，影响分离结果;相同的pH条件下，从分离和峰形综合考虑，本实验选择30mmol/L硼砂作运行缓冲液.pH对结果影响较大，在pH9.3-10.1的范围，分离效果逐渐改善，到pH9.9时变化较明显.我们选择了一些有机溶剂和表面活性剂，除150g/L异丙醇，分离效果未见改善.因此，用30 mmol/LpH9.9的硼砂溶液，150 g/L异丙醇作添加剂可成功分离17种氨基酸，缬氨酸和三种芳香族氨基酸基线分离，亮氨酸、异亮氨酸与其他成分基线分离，可准确定量15种氨基酸和支芳比，基本满足临床需要.用18种氨基酸标准液进行电泳，其中12种氨基酸可达到完全分离，得到15个峰，苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺无法单独分离，另外，丝氨酸出现两个峰.我们采用的2，4-二硝基氟苯，最初被用来进行氨基酸的测序，该法稳定、摩尔吸光系数大，且能与二级氨基反应，其不足之处是与谷氨酸的衍生化反应较慢[8]，且衍生化反应容易使样品受到污染.鉴于此，人们一直在寻找无需衍生、简易的氨基酸分析方法.作为经典的判断肝病氨基酸代谢异常的指标，血清支链氨基酸与芳香氨基酸之比(BCAA/AAA)已被广泛应用.肝病时血浆氨基酸变化主要表现为支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸又称BCAA)降低，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸又称AAA)升高，支/芳比降低[9-10].在我们的研究中，支持这一结论.在肝硬化组丙氨酸明显下降;肝癌组苏氨酸明显升高，脯氨酸明显下降，缬氨酸有代偿性升高.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Ninomiya T, Yoon S, Sugano M, Kumon Y, Seo Y, Shimizu K, Nagano H, Kasuga M, Hayashi Y. Improvement of molar
ratio of branched-chain amino acids to tyrosine(BTR)associated with liver fibrosis in chronic hepatitis C patients
treated with interferon-alpha. Dig Dis Sci 1999;44:1027-1033
2 Suzuki H, Mamata Y, Mizuno H, Tominaga T, Suga M, Suemori S, Sato A, Suzuki M. Influence of alcohol on
, http://www.100md.com
branched-chain amino acid/tyrosine molar ratio in patients with cirrhosis. Alcohol Clini Exp Res
1998;22(3 Suppl):137S-140S
3 Marchesini G, Bianchi G, Rossi B, Brizi M, Melchionda N. Nutritional treatment with branched-chain amino acids in
advanced liver cirrhosis. J Gastroenterol 2000;35(Suppl 12):7-12
4 Kawamura-Yasui N, Kaito M, Nakagawa N, Fujita N, Ikoma J, Gabazza EC, Watanabe S, Adachi Y. Evaluating response
, http://www.100md.com
to nutritional therapy using the branched-chain amino acid/tyrosine ratio in patients with chronic liver disease.
J Clin Lab Anal 1999;13:31-34
5 Barbul A. Arginine:biochemistry, physiology, and therapeutic implications.(review No abstract).
J Parenter Enteral Nutr 1986;10:227-238
6 Yu M, Dovichi NJ. Attomole amino acid determination by capillary zone electrophoresis with thermooptical
, http://www.100md.com
absorbance detection. Anal Chem 1989;61:37-40
7 Kuhr WG, Yeung ES. Indirect fluorescence detection of native amino acids in capillary zone electrophoresis.
Anal Chem 1988;60:1832-1834
8 She Z, Sun Z, Wu L, Wu K, Sun S, Huang Z. Rapid method for the determination of amino acids in serum by
capillary electrophoresis. J Chromatogr A 2002;979:227-232
, 百拇医药
9 沈同, 王镜岩, 赵邦悌. 生物化学. 第二版. 北京:高等教育出版社, 1990:116-117
10 Kano T, Nagaki M, Takahashi T, Ohnishi H, Saitoh K, Kimura K, Muto Y. Plasma free amino acid pattern in
chronic hepatitis as a sensitive and prognostic index. Gastroenterol Jpn 1991;26:344-349
编辑 张海宁, http://www.100md.com( 王跃国, 王惠民, 鞠少卿, 王忠慧, 宋红伟, 李 丽)
