肝细胞永生化:进展与挑战
陈耀凯, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所
重庆市 400038
陈耀凯, 男, 1966-12-27生, 河南省固始县人,汉族.第三军医大学西南医院全军感染病研究所副教授、副主任医师.先后承担及参加国家自然科学基金等基金资助项目5项，发表综述及论文70篇, 获重庆市及军队科技进步奖各1项.现为多家杂志常务编委、编委及审稿人.
国家自然科学基金资助,No. 30100080
国家自然科学基金资助,No. 30370391
项目负责人: 陈耀凯, 400038, 重庆市沙坪坝区高滩岩正街29号, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所. yaokaichen@hotmail.com
, 百拇医药
电话:023-68754475-8006 传真: 023-65461319
收稿日期:2005-01-10 接受日期: 2005-01-22
摘要
基于活性肝细胞为主要生物成分的肝细胞治疗学已逐渐成为治疗肝衰竭及先天性肝脏代谢性疾病的重要手段，但其关键是获得理想的肝细胞材料.肝细胞永生化是解决肝细胞来源的重要途径之一，这一领域的研究进展较为迅速.目前已经建立的肝细胞株包括肿瘤源性肝细胞株、由正常肝细胞经胶原凝胶夹心培养系统培养后而获得的肝细胞株、由正常肝细胞经转染/转导而获得的肝细胞株，以及p53或p19基因敲除而建立的肝细胞株等.上述肝细胞株多由肝肿瘤细胞衍变而来或经病毒转导而获得，因此存在安全性之虑.另外，多数肝细胞株的分化功能与原代细胞相比有不同程度地下降.为克服上述缺陷，国内外学者开始采用可回复性永生化方法，其基本原理是先将永生化基因SV40T导入原代细胞以获得永生化细胞株，使其获得体外增生能力，然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因，使细胞株回复到永生化前的状态.这样，肝细胞株既具有了永生化特性，又可解决安全性与分化功能差的缺点.从这一技术的发展现状及趋势看，进一步改善载体设计将是近期研究的热点.
, 百拇医药
关键词: 肝细胞;永生化
陈耀凯.肝细胞永生化:进展与挑战. 世界华人消化杂志 2005;13(3):273-275
(PDF) 特异性基因位点重组原理. A: 逆转录病毒载体; B: 整合原病毒; C: Cre介导位点重组; D: 重组后剩余载体序列.
6 今后的研究策略
与传统永生化方法相比，可回复性永生化显然具有较大的优势.但该方法目前仍存在一些缺陷:细胞必须经过两次病毒载体转导;不能保证永生化基因的彻底清除;第二次转导后重组酶基因留在细胞内，仍有可能与内源性序列发生重组导致染色体移位等;对重组酶活性不能实施有效控制.从这一技术的发展现状及趋势看，进一步改善载体设计将是近期研究的热点.我们曾提出采用一种新策略构建逆转录病毒载体(图2)，并以此实现人胎肝细胞的永生化与回复.主要特点是:(1)将永生化基因SV40T与重组酶Cre基因置于同一载体，转导一次完成;(2)SV40T与Cre均位于两个LoxP位点之间，将一同被切除;(3)Cre基因与雌激素受体(ER)配体结合区(LBD)编码基因构成融合基因，其产生融合蛋白(由Cre重组酶与LBD组成)的酶活性受配体(雌二醇，E2)控制，因而可通过E2控制Cre重组酶;(4)潮霉素磷酸转移酶与单纯疱疹病毒胸苷激酶的融合基因(HyTK)将使少数未发生重组的细胞在昔洛韦(GCV)的选择下死亡，进一步保证了回复肝细胞的安全性.对这一设想的研究目前仍在进行中，虽取得了一些重要进展，但尚未达到最终目标.
, http://www.100md.com
图2 (PDF) 本项目载体构建策略.
7 参考文献 1 Jauregui HO. The technology of biological extracorporeal liver assist devices: from infancy to adolescence.
Artif Organs 1997;21:1163-1168
2 Bilir BM, Guinette D, Karrer F, Kumpe DA, Krysl J, Stephens J, McGavran L, Ostrowska A, Durham J.
Hepatocyte transplantation in acute liver failure. Liver Transpl 2000;6:32-40
, 百拇医药
3 Davenport A. Artificial hepatic support. Where are we now? Blood Purif 2001;19:1-3
4 Kobayashi N, Okitsu T, Nakaji S, Tanaka N. Hybrid bioartificial liver:establishing a reversibly immortalized
human hepatocyte line and developing a bioartificial liver for practical use. J Artif Organs 2003;6:236-244
5 Tsiaoussis J, Newsome PN, Nelson LJ, Hayes PC, Plevris JN. Which hepatocyte will it be? Hepatocyte choice for
, 百拇医药
bioartificial liver support systems. Liver Transpl 2001;7:2-10
6 Kono Y, Yang S, Letarte M, Roberts EA. Establishment of a human hepatocyte line derived from primary culture
in a collagen gel sandwich culture system. Exp Cell Res 1995;221:478-485
7 Werner A, Duvar S, Muthing J, Buntemeyer H, Kahmann U, Lunsdorf H, Lehmann J. Cultivation and characterization
, 百拇医药
of a new immortalized human hepatocyte cell line, HepZ, for use in an artificial liver support system.
Ann N Y Acad Sci 1999;875:364-368
8 Wege H, Le HT, Chui MS, Liu L, Wu J, Giri R, Malhi H, Sappal BS, Kumaran V, Gupta S, Zern MA. Telomerase
reconstitution immortalizes human fetal hepatocytes without disrupting their differentiation potential.
Gastroenterology 2003;124:432-444
, http://www.100md.com
9 Liu J, Pan J, Naik S, Santangini H, Trenkler D, Thompson N, Rifai A, Chowdhury JR, Jauregui HO. Characterization
and evaluation of detoxification functions of a nontumorigenic immortalized porcine hepatocyte cell line(HepLiu).
CellTransplant 1999;8:219-232
10 Allain JE, Dagher I, Mahieu-Caputo D, Loux N, Andreoletti M, Westerman K, Briand P, Franco D, Leboulch P,Weber A. Immortalization of a primate bipotent epithelial liver stem cell. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:3639-3644
, 百拇医药
11 Dumble ML, Croager EJ, Yeoh GC, Quail EA. Generation and characterization of p53 null transformed hepatic
progenitor cells:oval cells give rise to hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis 2002;23:435-445
12 Mikula M, Fuchs E, Huber H, Beug H, Schulte-Hermann R, Mikulits W. Immortalized p19ARF null hepatocytes restore
liver injury and generate hepatic progenitors after transplantation. Hepatology 2004;39:628-634
, 百拇医药
13 Berghella L, De Angelis L, Coletta M, Berarducci B, Sonnino C, Salvatori G, Anthonissen C, Cooper R,Butler-Browne GS, Mouly V, Ferrari G, Mavilio F, Cossu G. Reversible immortalization of human myogenic cells by
site-specific excision of a retrovirally transferred oncogene. Hum Gene Ther 1999;10:1607-1617
14 Noguchi H, Kobayashi N, Westerman KA, Sakaguchi M, Okitsu T, Totsugawa T, Watanabe T, Matsumura T,Fujiwara T, Ueda T, Miyazaki M, Tanaka N, Leboulch P. Controlled expansion of human endothelial cell populations
, http://www.100md.com
by Cre-loxP-based reversible immortalization. Hum Gene Ther 2002;13:321-334
15 Kobayashi N, Noguchi H, Westerman KA, Matsumura T, Watanabe T, Totsugawa T, Fujiwara T, Leboulch P, Tanaka
N. Efficient Cre/loxP site-specific recombination in a HepG2 human liver cell line. Cell Transplant 2000;9:737-742
16 Kobayashi N, Noguchi H, Fujiwara T, Tanaka N. Establishment of a reversibly immortalized human hepatocyte cell line
, http://www.100md.com
by using Cre/loxP site-specific recombination. Transplant Proc 2000;32:1121-1122
17 Kobayashit N, Tanaka N. Engineering of human hepatocyte lines for cell therapies in humans: prospects and
remaining hurdles. Cell Transplant 2002;11:417-420
18 Salmon P, Oberholzer J, Occhiodoro T, Morel P, Lou J, Trono D. Reversible immortalization of human primary cells
, http://www.100md.com
by lentivector-mediated transfer of specific genes. Mol Ther 2000;2:404-414
19 Sato Y, Endo H, Ajiki T, Hakamata Y, Okada T, Murakami T, Kobayashi E. Establishment of Cre/LoxP recombination
system in transgenic rats. Biochem Biophys Res Commun 2004;319:1197-1202
编辑 张海宁, 百拇医药
重庆市 400038
陈耀凯, 男, 1966-12-27生, 河南省固始县人,汉族.第三军医大学西南医院全军感染病研究所副教授、副主任医师.先后承担及参加国家自然科学基金等基金资助项目5项，发表综述及论文70篇, 获重庆市及军队科技进步奖各1项.现为多家杂志常务编委、编委及审稿人.
国家自然科学基金资助,No. 30100080
国家自然科学基金资助,No. 30370391
项目负责人: 陈耀凯, 400038, 重庆市沙坪坝区高滩岩正街29号, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所. yaokaichen@hotmail.com
, 百拇医药
电话:023-68754475-8006 传真: 023-65461319
收稿日期:2005-01-10 接受日期: 2005-01-22
摘要
基于活性肝细胞为主要生物成分的肝细胞治疗学已逐渐成为治疗肝衰竭及先天性肝脏代谢性疾病的重要手段，但其关键是获得理想的肝细胞材料.肝细胞永生化是解决肝细胞来源的重要途径之一，这一领域的研究进展较为迅速.目前已经建立的肝细胞株包括肿瘤源性肝细胞株、由正常肝细胞经胶原凝胶夹心培养系统培养后而获得的肝细胞株、由正常肝细胞经转染/转导而获得的肝细胞株，以及p53或p19基因敲除而建立的肝细胞株等.上述肝细胞株多由肝肿瘤细胞衍变而来或经病毒转导而获得，因此存在安全性之虑.另外，多数肝细胞株的分化功能与原代细胞相比有不同程度地下降.为克服上述缺陷，国内外学者开始采用可回复性永生化方法，其基本原理是先将永生化基因SV40T导入原代细胞以获得永生化细胞株，使其获得体外增生能力，然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因，使细胞株回复到永生化前的状态.这样，肝细胞株既具有了永生化特性，又可解决安全性与分化功能差的缺点.从这一技术的发展现状及趋势看，进一步改善载体设计将是近期研究的热点.
, 百拇医药
关键词: 肝细胞;永生化
陈耀凯.肝细胞永生化:进展与挑战. 世界华人消化杂志 2005;13(3):273-275
(PDF) 特异性基因位点重组原理. A: 逆转录病毒载体; B: 整合原病毒; C: Cre介导位点重组; D: 重组后剩余载体序列.
6 今后的研究策略
与传统永生化方法相比，可回复性永生化显然具有较大的优势.但该方法目前仍存在一些缺陷:细胞必须经过两次病毒载体转导;不能保证永生化基因的彻底清除;第二次转导后重组酶基因留在细胞内，仍有可能与内源性序列发生重组导致染色体移位等;对重组酶活性不能实施有效控制.从这一技术的发展现状及趋势看，进一步改善载体设计将是近期研究的热点.我们曾提出采用一种新策略构建逆转录病毒载体(图2)，并以此实现人胎肝细胞的永生化与回复.主要特点是:(1)将永生化基因SV40T与重组酶Cre基因置于同一载体，转导一次完成;(2)SV40T与Cre均位于两个LoxP位点之间，将一同被切除;(3)Cre基因与雌激素受体(ER)配体结合区(LBD)编码基因构成融合基因，其产生融合蛋白(由Cre重组酶与LBD组成)的酶活性受配体(雌二醇，E2)控制，因而可通过E2控制Cre重组酶;(4)潮霉素磷酸转移酶与单纯疱疹病毒胸苷激酶的融合基因(HyTK)将使少数未发生重组的细胞在昔洛韦(GCV)的选择下死亡，进一步保证了回复肝细胞的安全性.对这一设想的研究目前仍在进行中，虽取得了一些重要进展，但尚未达到最终目标.
, http://www.100md.com
图2 (PDF) 本项目载体构建策略.
7 参考文献 1 Jauregui HO. The technology of biological extracorporeal liver assist devices: from infancy to adolescence.
Artif Organs 1997;21:1163-1168
2 Bilir BM, Guinette D, Karrer F, Kumpe DA, Krysl J, Stephens J, McGavran L, Ostrowska A, Durham J.
Hepatocyte transplantation in acute liver failure. Liver Transpl 2000;6:32-40
, 百拇医药
3 Davenport A. Artificial hepatic support. Where are we now? Blood Purif 2001;19:1-3
4 Kobayashi N, Okitsu T, Nakaji S, Tanaka N. Hybrid bioartificial liver:establishing a reversibly immortalized
human hepatocyte line and developing a bioartificial liver for practical use. J Artif Organs 2003;6:236-244
5 Tsiaoussis J, Newsome PN, Nelson LJ, Hayes PC, Plevris JN. Which hepatocyte will it be? Hepatocyte choice for
, 百拇医药
bioartificial liver support systems. Liver Transpl 2001;7:2-10
6 Kono Y, Yang S, Letarte M, Roberts EA. Establishment of a human hepatocyte line derived from primary culture
in a collagen gel sandwich culture system. Exp Cell Res 1995;221:478-485
7 Werner A, Duvar S, Muthing J, Buntemeyer H, Kahmann U, Lunsdorf H, Lehmann J. Cultivation and characterization
, 百拇医药
of a new immortalized human hepatocyte cell line, HepZ, for use in an artificial liver support system.
Ann N Y Acad Sci 1999;875:364-368
8 Wege H, Le HT, Chui MS, Liu L, Wu J, Giri R, Malhi H, Sappal BS, Kumaran V, Gupta S, Zern MA. Telomerase
reconstitution immortalizes human fetal hepatocytes without disrupting their differentiation potential.
Gastroenterology 2003;124:432-444
, http://www.100md.com
9 Liu J, Pan J, Naik S, Santangini H, Trenkler D, Thompson N, Rifai A, Chowdhury JR, Jauregui HO. Characterization
and evaluation of detoxification functions of a nontumorigenic immortalized porcine hepatocyte cell line(HepLiu).
CellTransplant 1999;8:219-232
10 Allain JE, Dagher I, Mahieu-Caputo D, Loux N, Andreoletti M, Westerman K, Briand P, Franco D, Leboulch P,Weber A. Immortalization of a primate bipotent epithelial liver stem cell. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:3639-3644
, 百拇医药
11 Dumble ML, Croager EJ, Yeoh GC, Quail EA. Generation and characterization of p53 null transformed hepatic
progenitor cells:oval cells give rise to hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis 2002;23:435-445
12 Mikula M, Fuchs E, Huber H, Beug H, Schulte-Hermann R, Mikulits W. Immortalized p19ARF null hepatocytes restore
liver injury and generate hepatic progenitors after transplantation. Hepatology 2004;39:628-634
, 百拇医药
13 Berghella L, De Angelis L, Coletta M, Berarducci B, Sonnino C, Salvatori G, Anthonissen C, Cooper R,Butler-Browne GS, Mouly V, Ferrari G, Mavilio F, Cossu G. Reversible immortalization of human myogenic cells by
site-specific excision of a retrovirally transferred oncogene. Hum Gene Ther 1999;10:1607-1617
14 Noguchi H, Kobayashi N, Westerman KA, Sakaguchi M, Okitsu T, Totsugawa T, Watanabe T, Matsumura T,Fujiwara T, Ueda T, Miyazaki M, Tanaka N, Leboulch P. Controlled expansion of human endothelial cell populations
, http://www.100md.com
by Cre-loxP-based reversible immortalization. Hum Gene Ther 2002;13:321-334
15 Kobayashi N, Noguchi H, Westerman KA, Matsumura T, Watanabe T, Totsugawa T, Fujiwara T, Leboulch P, Tanaka
N. Efficient Cre/loxP site-specific recombination in a HepG2 human liver cell line. Cell Transplant 2000;9:737-742
16 Kobayashi N, Noguchi H, Fujiwara T, Tanaka N. Establishment of a reversibly immortalized human hepatocyte cell line
, http://www.100md.com
by using Cre/loxP site-specific recombination. Transplant Proc 2000;32:1121-1122
17 Kobayashit N, Tanaka N. Engineering of human hepatocyte lines for cell therapies in humans: prospects and
remaining hurdles. Cell Transplant 2002;11:417-420
18 Salmon P, Oberholzer J, Occhiodoro T, Morel P, Lou J, Trono D. Reversible immortalization of human primary cells
, http://www.100md.com
by lentivector-mediated transfer of specific genes. Mol Ther 2000;2:404-414
19 Sato Y, Endo H, Ajiki T, Hakamata Y, Okada T, Murakami T, Kobayashi E. Establishment of Cre/LoxP recombination
system in transgenic rats. Biochem Biophys Res Commun 2004;319:1197-1202
编辑 张海宁, 百拇医药
