ntPCR-RFLP检测HBV阿德福韦耐药变异-rtN236T变异
闫杰, 谢雯,欧蔚妮, 李蕴铷, 北京地坛医院五病区 北京市 100011
冯鑫,宋淑静, 北京地坛医院病毒研究室 北京市 100011
王磊,山东大学医学院济南市传染病医院四病区 山东省济南市 250021
首都医学发展科研基金,No. 2002-3046
山东省卫生厅计划项目,No. 2001CA1CAA11
项目负责人:闫杰, 100011, 北京市安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院五病区.jieyan@bbn.cn
, 百拇医药
电话:010-64211031-2330 传真: 010-64281540
收稿日期:2004-11-23 接受日期: 2004-11-29
摘要
目的:建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异的快速检测方法.
方法:根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物，使野生株(rt236N)PCR产物中含有DraI酶切位点(5’TTTAAA3’)，而变异株(rt236T)无此限制性酶切位点.同时PCR扩增2份已行HBVRT区基因测序证实未出现rtN236T变异的慢性乙型肝炎患者血清及自行构建的对照质粒，扩增产物经DraI酶切，30 g/L琼脂糖凝胶电泳后，进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析.
, http://www.100md.com
结果:所建立的ntPCR-RFLP方法灵敏度高，可以检测到106copies/L的HBVDNA;特异性强，其RFLP分析结果与DNA
测序结果一致.
结论:ntPCR-RFLP方法灵敏、特异、简便、实用，适用于ADV耐药变异的临床监测工作.
闫杰,冯鑫, 王磊,宋淑静,谢雯, 欧蔚妮,李蕴铷.ntPCR-RFLP检测HBV阿德福韦耐药变异-rtN236T变异. 世界华人消化杂志 2005;13(4):543-545
(PDF) PCR-RFLP检测rtN236T变异的设计.
表1 PCR引物序列
2 结果对照质粒序列测定结果与预期结果一致，表明对照质粒构建成功(图2).以不同HBV DNA浓度的血清提取物为模板进行PCR检测，终检浓度为106copies/L(HBVDNA荧光定量试剂盒购自深圳匹基生物技术公司)，表明该巢式PCR反应具有良好的灵敏度.阳性标本PCR产物大小与预期值相符，为304bp(图3)，且PCR产物克隆(即野生型对照质粒)测序结果与此前所测得的HBVRT区基因序列之间的核苷酸同源性为97.5%，表明该巢式PCR反应具有高度特异性.RFLP分析DraI酶切后电泳结果显示，两血清标本与野生型对照质粒的巢式PCR产物均被完全酶切，而变异型对照质粒未被酶切(图4);该结果与DNA序列测定结果一致.
, http://www.100md.com
图2 (PDF) 对照质粒测序结果. W: 野生型对照质粒;A: 野生型对照质粒(nt: AAC，aa: N); B: 变异型对照质粒(nt: ACC，aa: T).
图3 (PDF) PCR产物电泳结果. W:野生型对照质粒; M: 变异型对照质粒;216、393: 血清标本; N: 空白对照;DGL2000 DNA Marker.
图4 (PDF) DraI酶切产物电泳结果. M: 变异型对照质粒;216、393: 血清标本; N: 空白对照;DGL2000 DNA Marker.
3 讨论时至今日慢性HBV感染仍是一个全球性的难题，全世界约有3.5亿人感染，与之相关的年死亡人数约为1200 000[7].因此针对HBV的抗病毒治疗受到广泛重视.随着对HBV聚合酶的结构和功能的深入认识，一些有效抑制HBVDNA复制的核苷类药物(如:拉米夫定、ADV)逐步成为抗HBV治疗的新选择[8-9].由于HBV聚合酶如同其他逆转录病毒的逆转录酶一样具有较高的错配倾向且缺乏校对能力，因此随着感染的持续病毒准种逐年增多[10-11].在核苷类药物的选择压力下，耐药变异株将逐渐增多，最终替代野生株成为优势株，从而导致临床耐药现象的出现.多个研究中心相继报道rtN236T变异与ADV耐药有关，并在体外实验中证实该变异可显著降低HBV对ADV的敏感性[5-6，12-13].
, http://www.100md.com
我国HBV慢性感染患者众多，在ADV广泛应用之前应建立完善的耐药监测体系以指导临床合理用药，为此亟待建立一种简便、快速的rtN236T变异检测方法[14].
基于ntPCR-RFLP技术的拉米夫定耐药变异检测方法已为国内众多实验室广泛应用，具有灵敏、特异、简便、实用之优点[15-18];因此我们再次选择该技术用以构建rtN236T变异检测方法.为提高PCR扩增效率，在引物设计时选择我国常见基因型-B型和C型[19-22]为模板.为降低成本和方便操作，在RFLP分析过程中选用30g/L琼脂糖凝胶电泳，而未使用分辨率高但价格较贵、操作繁琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳.该方法更符合我国现状且经济、简便、实用，以便在国内推广，建立全国性的完善的ADV耐药监测体系.
4 参考文献1 Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, Chang TT, Kitis G, Rizzetto M, MarcellinP, Lim SG, Goodman Z,Wulfsohn MS, Xiong S, Fry J, Brosgart CL; AdefovirDipivoxil 438 Study Group. Adefovir dipivoxil for the treatment
, 百拇医药
ofhepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B. N Engl J Med 2003;348:800-807
2 Marcellin P,Chang TT, Lim SG, Tong MJ, Sievert W, Shiffman ML, Jeffers L, Goodman Z,Wulfsohn MS, Xiong S,Fry J, Brosgart CL;Adefovir Dipivoxil 437 StudyGroup. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis B e
antigen-positive chronic hepatitis B. N Engl J Med 2003;348:808-816
3 黄世杰. FDA批准阿德福韦治疗乙型肝炎. 国外医学. 药学分册 2003;30:63
, 百拇医药
4 Schiff ER, Lai CL, Hadziyannis S, Neuhaus P, Terrault N, Colombo M,Tillmann HL, Samuel D, Zeuzem S, Lilly L,Rendina M, Villeneuve JP, Lama N, James C,Wulfsohn MS, Namini H, Westland C, Xiong S, Choy GS, Van Doren S,Fry J, Brosgart CL;Behalf of the AdefovirDipovoxil Study 435 International Investigators Group. Adefovir dipivoxil
therapy for lamivudine-resistant hepatitisB in pre- and post-liver transplantation patients. Hepatology
, 百拇医药
2003;38:1419-1427
5 Angus P, Vaughan R, Xiong S, Yang H, Delaney W, Gibbs C, BrosgartC, Colledge D, Edwards R, Ayres A,Bartholomeusz A, Locarnini S. Resistance toadefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novelmutation
in the HBV polymerase. Gastroenterology 2003;125:292-297
6 Villeneuve JP, Durantel D, Durantel S, Westland C, Xiong S,Brosgart CL, Gibbs CS, Parvaz P, Werle B, Trepo C,Zoulim F. Selection of a hepatitis B virusstrain resistant to adefovir in a liver transplantation patient. JHepatol
, 百拇医药
2003;39:1085-1089
7 Lok AS. Chronic hepatitis B. N Engl J Med 2002;346:1682-1683
8 De Clercq E. Antiviral drugs in current clinical use. J ClinVirol 2004;30:115-133
9 Humphries JC, Dixon JS. Antivirals for the treatment of chronichepatitis B: current and future options.
Intervirology 2003;46:413-420
10 Stuyver LJ, Locarnini SA, Lok A, Richman DD, Carman WF, Dienstag JL,Schinazi RF. Nomenclature for
, 百拇医药
antiviral-resistant human hepatitis Bvirus mutations in the polymerase region. Hepatology 2001;33:751-757
11 Stuyver L, Van Geyt C, De Gendt S, Van Reybroeck G, Zoulim F,Leroux-Roels G, Rossau R. Line probe assay
for monitoring drug resistance inhepatitis B virus-infected patients during antiviral therapy. J ClinMicrobiol
2000;38:702-707
12 Bartholomeusz A, Tehan BG, Chalmers DK. Comparisons of the HBV andHIV polymerase, and antiviral resistance
, 百拇医药
mutations. Antivir Ther 2004;9:149-160
13 Yadav V, Chu CK. Molecular mechanisms of adefovir sensitivity andresistance in HBV polymerase mutants:a
molecular dynamics study. BioorgMed Chem Lett 2004;14:4313-4317
14 茅益民, 曾民德. 抗乙型病毒性肝炎新药-阿德福韦酯. 中华肝脏病杂志 2004;12:61-63
15 封波, 魏来, 陈明, 李秀华. 包含YMDD基因序列的乙型肝炎病毒P区基因变异的研究.
中华肝脏病杂志 2004;12:29-31
, http://www.100md.com
16 丁静娟, 张伟三, 张莉莎. 乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法研究.
中华实验和临床病毒学杂志 2004;18:24-27
17 赵平, 李捍卫, 楼敏, 程勇前, 兰云, 福军亮. 拉米夫定耐药的慢性乙肝患者联合干扰素或苦参素治
疗疗效观察. 中华实验和临床病毒学杂志 2004;18:80-82
18 刘艳, 胡毅文, 乐晓华, 王召钦, 袁静, 林奕, 骆子义, 蒋小玲. 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎1-3 a随访结果.
中华传染病杂志 2004;22;204-206
19 许军, 王齐欣, 范春蕾, 蒋栋, 李若冰, 丛旭, 费然, 陈红松, 魏来, 王宇. 中国南北两城市乙型肝炎病毒
, http://www.100md.com
基因型与血清型的构成差异. 中华实验和临床病毒学杂志 2003;17:327-329
20 杨洁, 戴琳, 郭亚兵, 杨守昌, 王燕军, 骆抗先. 应用多重PCR法对广东地区HBV进行基因型(A-F)分型.
第一军医大学学报 2002;22:707-709
21 葛宪民, 李丹亚, 方钟燎, 黄果勇, 江世强, 潘海东, 杜岩, 王超英, 丁欣, 沟上雅史. 广西乙型肝炎病毒基因
分型及其临床意义的研究. 中华实验和临床病毒学杂志 2003;17:174-179
22 宋淑静, 何忠平, 庄辉, 闫杰, 董庆鸣. 中国北方5 城市慢性乙型肝炎患者的基因分型.
中国公共卫生 2004;20:166-167
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, http://www.100md.com( 闫 杰, 冯 鑫, 王 磊, 宋淑静, 谢 雯, 欧蔚妮, 李蕴铷)
冯鑫,宋淑静, 北京地坛医院病毒研究室 北京市 100011
王磊,山东大学医学院济南市传染病医院四病区 山东省济南市 250021
首都医学发展科研基金,No. 2002-3046
山东省卫生厅计划项目,No. 2001CA1CAA11
项目负责人:闫杰, 100011, 北京市安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院五病区.jieyan@bbn.cn
, 百拇医药
电话:010-64211031-2330 传真: 010-64281540
收稿日期:2004-11-23 接受日期: 2004-11-29
摘要
目的:建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异的快速检测方法.
方法:根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物，使野生株(rt236N)PCR产物中含有DraI酶切位点(5’TTTAAA3’)，而变异株(rt236T)无此限制性酶切位点.同时PCR扩增2份已行HBVRT区基因测序证实未出现rtN236T变异的慢性乙型肝炎患者血清及自行构建的对照质粒，扩增产物经DraI酶切，30 g/L琼脂糖凝胶电泳后，进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析.
, http://www.100md.com
结果:所建立的ntPCR-RFLP方法灵敏度高，可以检测到106copies/L的HBVDNA;特异性强，其RFLP分析结果与DNA
测序结果一致.
结论:ntPCR-RFLP方法灵敏、特异、简便、实用，适用于ADV耐药变异的临床监测工作.
闫杰,冯鑫, 王磊,宋淑静,谢雯, 欧蔚妮,李蕴铷.ntPCR-RFLP检测HBV阿德福韦耐药变异-rtN236T变异. 世界华人消化杂志 2005;13(4):543-545
(PDF) PCR-RFLP检测rtN236T变异的设计.
表1 PCR引物序列
, http://www.100md.com 引物 | nt | 序列 |
P1 | 105-122 | 5’CCTCACCCATATCGTCAA3’ |
P2 | 1255-1238 | 5’CCTCACCCATATCGTCAA3’ |
ADVup1 | , http://www.100md.com 815-835 | 5’TGTCTTTGGGTATACATTTAA3’ |
ADVlow | 1103-1118 | 5’AAGGCCTTGTAAGTTG3’ |
ADVup2 | 815-838 | 5’TGTCTTTGGGTATACATTTAACCC3’ |
2 结果对照质粒序列测定结果与预期结果一致，表明对照质粒构建成功(图2).以不同HBV DNA浓度的血清提取物为模板进行PCR检测，终检浓度为106copies/L(HBVDNA荧光定量试剂盒购自深圳匹基生物技术公司)，表明该巢式PCR反应具有良好的灵敏度.阳性标本PCR产物大小与预期值相符，为304bp(图3)，且PCR产物克隆(即野生型对照质粒)测序结果与此前所测得的HBVRT区基因序列之间的核苷酸同源性为97.5%，表明该巢式PCR反应具有高度特异性.RFLP分析DraI酶切后电泳结果显示，两血清标本与野生型对照质粒的巢式PCR产物均被完全酶切，而变异型对照质粒未被酶切(图4);该结果与DNA序列测定结果一致.
, http://www.100md.com
图2 (PDF) 对照质粒测序结果. W: 野生型对照质粒;A: 野生型对照质粒(nt: AAC，aa: N); B: 变异型对照质粒(nt: ACC，aa: T).
图3 (PDF) PCR产物电泳结果. W:野生型对照质粒; M: 变异型对照质粒;216、393: 血清标本; N: 空白对照;DGL2000 DNA Marker.
图4 (PDF) DraI酶切产物电泳结果. M: 变异型对照质粒;216、393: 血清标本; N: 空白对照;DGL2000 DNA Marker.
3 讨论时至今日慢性HBV感染仍是一个全球性的难题，全世界约有3.5亿人感染，与之相关的年死亡人数约为1200 000[7].因此针对HBV的抗病毒治疗受到广泛重视.随着对HBV聚合酶的结构和功能的深入认识，一些有效抑制HBVDNA复制的核苷类药物(如:拉米夫定、ADV)逐步成为抗HBV治疗的新选择[8-9].由于HBV聚合酶如同其他逆转录病毒的逆转录酶一样具有较高的错配倾向且缺乏校对能力，因此随着感染的持续病毒准种逐年增多[10-11].在核苷类药物的选择压力下，耐药变异株将逐渐增多，最终替代野生株成为优势株，从而导致临床耐药现象的出现.多个研究中心相继报道rtN236T变异与ADV耐药有关，并在体外实验中证实该变异可显著降低HBV对ADV的敏感性[5-6，12-13].
, http://www.100md.com
我国HBV慢性感染患者众多，在ADV广泛应用之前应建立完善的耐药监测体系以指导临床合理用药，为此亟待建立一种简便、快速的rtN236T变异检测方法[14].
基于ntPCR-RFLP技术的拉米夫定耐药变异检测方法已为国内众多实验室广泛应用，具有灵敏、特异、简便、实用之优点[15-18];因此我们再次选择该技术用以构建rtN236T变异检测方法.为提高PCR扩增效率，在引物设计时选择我国常见基因型-B型和C型[19-22]为模板.为降低成本和方便操作，在RFLP分析过程中选用30g/L琼脂糖凝胶电泳，而未使用分辨率高但价格较贵、操作繁琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳.该方法更符合我国现状且经济、简便、实用，以便在国内推广，建立全国性的完善的ADV耐药监测体系.
4 参考文献1 Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, Chang TT, Kitis G, Rizzetto M, MarcellinP, Lim SG, Goodman Z,Wulfsohn MS, Xiong S, Fry J, Brosgart CL; AdefovirDipivoxil 438 Study Group. Adefovir dipivoxil for the treatment
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ofhepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B. N Engl J Med 2003;348:800-807
2 Marcellin P,Chang TT, Lim SG, Tong MJ, Sievert W, Shiffman ML, Jeffers L, Goodman Z,Wulfsohn MS, Xiong S,Fry J, Brosgart CL;Adefovir Dipivoxil 437 StudyGroup. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis B e
antigen-positive chronic hepatitis B. N Engl J Med 2003;348:808-816
3 黄世杰. FDA批准阿德福韦治疗乙型肝炎. 国外医学. 药学分册 2003;30:63
, 百拇医药
4 Schiff ER, Lai CL, Hadziyannis S, Neuhaus P, Terrault N, Colombo M,Tillmann HL, Samuel D, Zeuzem S, Lilly L,Rendina M, Villeneuve JP, Lama N, James C,Wulfsohn MS, Namini H, Westland C, Xiong S, Choy GS, Van Doren S,Fry J, Brosgart CL;Behalf of the AdefovirDipovoxil Study 435 International Investigators Group. Adefovir dipivoxil
therapy for lamivudine-resistant hepatitisB in pre- and post-liver transplantation patients. Hepatology
, 百拇医药
2003;38:1419-1427
5 Angus P, Vaughan R, Xiong S, Yang H, Delaney W, Gibbs C, BrosgartC, Colledge D, Edwards R, Ayres A,Bartholomeusz A, Locarnini S. Resistance toadefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novelmutation
in the HBV polymerase. Gastroenterology 2003;125:292-297
6 Villeneuve JP, Durantel D, Durantel S, Westland C, Xiong S,Brosgart CL, Gibbs CS, Parvaz P, Werle B, Trepo C,Zoulim F. Selection of a hepatitis B virusstrain resistant to adefovir in a liver transplantation patient. JHepatol
, 百拇医药
2003;39:1085-1089
7 Lok AS. Chronic hepatitis B. N Engl J Med 2002;346:1682-1683
8 De Clercq E. Antiviral drugs in current clinical use. J ClinVirol 2004;30:115-133
9 Humphries JC, Dixon JS. Antivirals for the treatment of chronichepatitis B: current and future options.
Intervirology 2003;46:413-420
10 Stuyver LJ, Locarnini SA, Lok A, Richman DD, Carman WF, Dienstag JL,Schinazi RF. Nomenclature for
, 百拇医药
antiviral-resistant human hepatitis Bvirus mutations in the polymerase region. Hepatology 2001;33:751-757
11 Stuyver L, Van Geyt C, De Gendt S, Van Reybroeck G, Zoulim F,Leroux-Roels G, Rossau R. Line probe assay
for monitoring drug resistance inhepatitis B virus-infected patients during antiviral therapy. J ClinMicrobiol
2000;38:702-707
12 Bartholomeusz A, Tehan BG, Chalmers DK. Comparisons of the HBV andHIV polymerase, and antiviral resistance
, 百拇医药
mutations. Antivir Ther 2004;9:149-160
13 Yadav V, Chu CK. Molecular mechanisms of adefovir sensitivity andresistance in HBV polymerase mutants:a
molecular dynamics study. BioorgMed Chem Lett 2004;14:4313-4317
14 茅益民, 曾民德. 抗乙型病毒性肝炎新药-阿德福韦酯. 中华肝脏病杂志 2004;12:61-63
15 封波, 魏来, 陈明, 李秀华. 包含YMDD基因序列的乙型肝炎病毒P区基因变异的研究.
中华肝脏病杂志 2004;12:29-31
, http://www.100md.com
16 丁静娟, 张伟三, 张莉莎. 乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法研究.
中华实验和临床病毒学杂志 2004;18:24-27
17 赵平, 李捍卫, 楼敏, 程勇前, 兰云, 福军亮. 拉米夫定耐药的慢性乙肝患者联合干扰素或苦参素治
疗疗效观察. 中华实验和临床病毒学杂志 2004;18:80-82
18 刘艳, 胡毅文, 乐晓华, 王召钦, 袁静, 林奕, 骆子义, 蒋小玲. 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎1-3 a随访结果.
中华传染病杂志 2004;22;204-206
19 许军, 王齐欣, 范春蕾, 蒋栋, 李若冰, 丛旭, 费然, 陈红松, 魏来, 王宇. 中国南北两城市乙型肝炎病毒
, http://www.100md.com
基因型与血清型的构成差异. 中华实验和临床病毒学杂志 2003;17:327-329
20 杨洁, 戴琳, 郭亚兵, 杨守昌, 王燕军, 骆抗先. 应用多重PCR法对广东地区HBV进行基因型(A-F)分型.
第一军医大学学报 2002;22:707-709
21 葛宪民, 李丹亚, 方钟燎, 黄果勇, 江世强, 潘海东, 杜岩, 王超英, 丁欣, 沟上雅史. 广西乙型肝炎病毒基因
分型及其临床意义的研究. 中华实验和临床病毒学杂志 2003;17:174-179
22 宋淑静, 何忠平, 庄辉, 闫杰, 董庆鸣. 中国北方5 城市慢性乙型肝炎患者的基因分型.
中国公共卫生 2004;20:166-167
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, http://www.100md.com( 闫 杰, 冯 鑫, 王 磊, 宋淑静, 谢 雯, 欧蔚妮, 李蕴铷)
