抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响
安家泽,窦科峰, 中国人民解放军第四军医大学西京医院肝胆外科 陕西省西安市 710032
董宏林,山西医科大学第二医院肝胆外科 山西省太原市 030001
项目负责人:安家泽, 710032, 陕西省西安市长乐西路17号, 中国人民解放军第四军医大学西京医院肝胆外科. anchen@fmmu.edu.cn
电话: 029-83375259
收稿日期: 2004-12-10 接受日期: 2005-01-08
摘要
, 百拇医药
目的:探讨抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞的抑制作用.
方法:利用脂质体介导法将真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1基因导入肝癌细胞株HHCC细胞中，经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆，用MTT、3H-TdR掺入法和克隆形成实验观察抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响，电子显微镜技术探讨过表达的p27Kip1抑制肝癌细胞生长的可能机制.
结果:抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成均有明显抑制作用，抑制率达56%(P<0.01 vs 转染空载体组)，电镜结果显示肝癌细胞发生凋亡.
, 百拇医药
结论:抑癌基因p27Kip1可能通过诱导肝癌细胞凋亡抑制肝癌细胞生长.
安家泽, 董宏林, 窦科峰. 抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响. 世界华人消化杂志 2005;13(4):548-550
(PDF) p27Kip1蛋白表达的Western blot检测. A: Protein marker; B: HHCC cells; C: HHCC cellstransfected by pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1; D: Non-transfected cells.
2.2 MTT实验结果 pcDNA3.1-p27明显抑制HHCC增生(P<0.01vspcDNA3.1)，而pcDNA3.1与空白对照组(blank control)相比无差异(P>0.05)(图2).
, 百拇医药
图2 (PDF)pcDNA3.1-p27对HHCC增生的影响.
2.33H-TdR实验结果 PcDNA3.1-P27对DNA合成(P<0.01vspcDNA3.1)有明显抑制作用，Blank control与pcDNA3.1
相比无差异(P>0.01)(图3).
图3 (PDF) PcDNA3.1-P27对HHCC DNA合成的影响.
2.4p27Kip1对HHCC细胞增生的影响(表1) 软琼脂克隆形成试验显示,过表达的p27Kip1能够抑制HHCC细胞的生长.各实验组与对照组之间相比有显著性差异(P<0.01，表1).
, 百拇医药
表1 过表达的p27Kip1对HHCC细胞的抑制率(%)
bP<0.01vs 转染空载体组.
, http://www.100md.com
2.5p27Kip1对HHCC细胞凋亡的影响 正常的肝癌细胞(HHCC)表面可见许多小的绒毛突起，胞核为椭圆形，位于细胞中部，核膜双层结构清晰可见，胞质内可见到的细胞器为线粒体、内质网和溶酶体等.转染p27Kip1基因组的HHCC细胞可见部分肝癌细胞体积明显缩小，胞核固缩，染色质致密，并边集于细胞核周边.细胞膜表面微绒毛消失，胞质中有空泡形成，是细胞凋亡的形态学改变(图4).
图4 (PDF) 肝癌细胞凋亡的形态学改变.
3 讨论肿瘤的恶性增生是肿瘤细胞的永生化和细胞分裂的失控，而细胞周期调节蛋白在正常细胞的生长和肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用.p27Kip1作为细胞周期抑制蛋白的成员之一，对肿瘤细胞的增生有一定的影响[2].为研究过表达的p27Kip1对肝癌的抑制作用，我们采用基因转染的方法建立了过表达p27Kip1的肝癌细胞模型.经Western Blot检测表明，最终克隆出来的转染细胞可100%表达p27Kip1蛋白，成功地建立了过表达p27Kip1蛋白的肝癌细胞株.
, 百拇医药
细胞周期素依赖性激酶(CDKs)是细胞周期进展的主要调节因子，因此也是肿瘤抑制性治疗的重要候选者.CDKs能够使Rb基因及其相关蛋白磷酸化，反过来又受到细胞周期素(cyclin)的水平、磷酸化和细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CKIs)的控制[3].目前已经发现两大类CKIs，一类是INK4(CDK4的抑制剂)家族，成员有P16，P15，P18和P19，他们是cyclinD1与CDK4或CDK6形成的复合物的抑制剂;另一类是P21家族，包括P21，P27和P57，他们是控制G1/S转换的CDK的抑制剂[4-5].
P27通过与各种cyclin-CDK复合物相互作用，从而抑制他们的活性，获得对细胞周期的调控.生理状态下，P27主要是通过与cyclinE-CDK2复合物的相互作用，从而调节细胞从G1后期到S期.目前认为P27是TGF-b、cAMP及其他细胞外因子诱导细胞生长停滞的主要递质[7].在正常情况下，p27Kip1在G0/G1期时表达增高，当细胞进入S期时则表达下降.虽然p27Kip1能广泛抑制各种周期蛋白和周期抑制蛋白(CDK)的活性，但主要抑制细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白D-CDK4等G1期激酶复合物，使细胞不能通过G1期[6].细胞凋亡多数发生于细胞周期的G1期、G1晚期或S期[8-9]，因此在G1晚期表达的蛋白如p27Kip1和p21Cip1无疑会参与凋亡的进程.我们以体外培养的人肝癌细胞系为靶细胞，以抑癌基因p27Kip1为目的基因，将构建的pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1真核表达质粒体外转染HHCC,用MTT、3H-TdR和克隆形成实验观察到抑癌基因p27Kip1对HHCC增生及其DNA合成均有明显抑制作用，抑制率约为56%.通过电子显微镜发现过表达的p27Kip1能够诱导HHCC细胞凋亡，即对细胞凋亡有促进作用，从而抑制肿瘤细胞的生长.关于p27kip1抑制肝癌细胞生长的机制还有待于进一步的探讨.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Polyak K, Lee MH, Erdjument-Bromage H, Koff A, Roberts JM, Tempst P, Massague J. Cloning of p27kip1, a
cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals. Cell 1994;78:59-66
2 Favrot M, Coll JL, Louis N, Negoescu A. Cell death and cancer: Replacement of apoptotic genes and inactivation of
death suppressor genes in therapy. Gene Ther 1998;5:728-739
, 百拇医药
3 Blagosklonny MV, Pardee AB. The restriction point of the cell cycle. Cell Cycle 2002;1:103-110
4 Nath N, Wang S, Betts V, Knudsen E, Chellappan S. Apoptotic and mitogenic stimuli inactivate Rb by differential
utilization of p38 and cyclin-dependent kinases. Oncogene 2003;22:5986-5994
5 Bryja V, Pachernik J, Faldikova L, Krejci P, Pogue R, Nevriva I, Dvorak P, Hampl A. The role of p27(Kip1) in maintaining
, http://www.100md.com
the levels of D-type cyclins in vivo. Biochim Biophys Acta 2004;1691:105-116
6 Shimizu T, Takahashi N, Tachibana K, Takeda K. Complex regulation of CDK2 and G1 arrest during neuronal
differentiation of human prostatic cancer TSU-Prl cells by staurosporine. Anticancer Res 2001;21:893-898
7 Kim TY, Kim WI, Smith RE, Kay ED. Role of p27(Kip1) in cAMP- and TGF-beta2-mediated antiproliferation in rabbit
, http://www.100md.com
corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:3142-3149
8 de Koning JP, Soede-Bobok AA, Ward AC, Schelen AM, Antonissen C, van Leeuwen D, Lowenberg B, Touw IP.
STAT3- mediated differentiation and survival and of myeloid cells in response to granulocyte colony-stimulating factor:
role for the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1). Oncogene 2000; 19:3290-3298
9 Alisi A, Leoni S, Piacentani A, Conti Devirgiliis L. Retinoic acid modulates the cell-cycle in fetal rat hepatocytes and
HepG2 cells by regulating cyclin-cdk activities. Liver Int 2003;23:179-186
编辑 张海宁, 百拇医药( 安家泽,董宏林, 窦科峰)
董宏林,山西医科大学第二医院肝胆外科 山西省太原市 030001
项目负责人:安家泽, 710032, 陕西省西安市长乐西路17号, 中国人民解放军第四军医大学西京医院肝胆外科. anchen@fmmu.edu.cn
电话: 029-83375259
收稿日期: 2004-12-10 接受日期: 2005-01-08
摘要
, 百拇医药
目的:探讨抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞的抑制作用.
方法:利用脂质体介导法将真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1基因导入肝癌细胞株HHCC细胞中，经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆，用MTT、3H-TdR掺入法和克隆形成实验观察抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响，电子显微镜技术探讨过表达的p27Kip1抑制肝癌细胞生长的可能机制.
结果:抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成均有明显抑制作用，抑制率达56%(P<0.01 vs 转染空载体组)，电镜结果显示肝癌细胞发生凋亡.
, 百拇医药
结论:抑癌基因p27Kip1可能通过诱导肝癌细胞凋亡抑制肝癌细胞生长.
安家泽, 董宏林, 窦科峰. 抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响. 世界华人消化杂志 2005;13(4):548-550
(PDF) p27Kip1蛋白表达的Western blot检测. A: Protein marker; B: HHCC cells; C: HHCC cellstransfected by pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1; D: Non-transfected cells.
2.2 MTT实验结果 pcDNA3.1-p27明显抑制HHCC增生(P<0.01vspcDNA3.1)，而pcDNA3.1与空白对照组(blank control)相比无差异(P>0.05)(图2).
, 百拇医药
图2 (PDF)pcDNA3.1-p27对HHCC增生的影响.
2.33H-TdR实验结果 PcDNA3.1-P27对DNA合成(P<0.01vspcDNA3.1)有明显抑制作用，Blank control与pcDNA3.1
相比无差异(P>0.01)(图3).
图3 (PDF) PcDNA3.1-P27对HHCC DNA合成的影响.
2.4p27Kip1对HHCC细胞增生的影响(表1) 软琼脂克隆形成试验显示,过表达的p27Kip1能够抑制HHCC细胞的生长.各实验组与对照组之间相比有显著性差异(P<0.01，表1).
, 百拇医药
表1 过表达的p27Kip1对HHCC细胞的抑制率(%)
细胞类型 | 克隆数 | 克隆形成率(%) | 抑制率(%) |
未转染组 | 25±3.3 | 8.33 | |
, http://www.100md.com 转染空载体组 | 23±2.6 | 7.67 | 8.00 |
转染p27kip1组 | 11±1.2 | 3.67b | 56.00b |
bP<0.01vs 转染空载体组.
, http://www.100md.com
2.5p27Kip1对HHCC细胞凋亡的影响 正常的肝癌细胞(HHCC)表面可见许多小的绒毛突起，胞核为椭圆形，位于细胞中部，核膜双层结构清晰可见，胞质内可见到的细胞器为线粒体、内质网和溶酶体等.转染p27Kip1基因组的HHCC细胞可见部分肝癌细胞体积明显缩小，胞核固缩，染色质致密，并边集于细胞核周边.细胞膜表面微绒毛消失，胞质中有空泡形成，是细胞凋亡的形态学改变(图4).
图4 (PDF) 肝癌细胞凋亡的形态学改变.
3 讨论肿瘤的恶性增生是肿瘤细胞的永生化和细胞分裂的失控，而细胞周期调节蛋白在正常细胞的生长和肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用.p27Kip1作为细胞周期抑制蛋白的成员之一，对肿瘤细胞的增生有一定的影响[2].为研究过表达的p27Kip1对肝癌的抑制作用，我们采用基因转染的方法建立了过表达p27Kip1的肝癌细胞模型.经Western Blot检测表明，最终克隆出来的转染细胞可100%表达p27Kip1蛋白，成功地建立了过表达p27Kip1蛋白的肝癌细胞株.
, 百拇医药
细胞周期素依赖性激酶(CDKs)是细胞周期进展的主要调节因子，因此也是肿瘤抑制性治疗的重要候选者.CDKs能够使Rb基因及其相关蛋白磷酸化，反过来又受到细胞周期素(cyclin)的水平、磷酸化和细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CKIs)的控制[3].目前已经发现两大类CKIs，一类是INK4(CDK4的抑制剂)家族，成员有P16，P15，P18和P19，他们是cyclinD1与CDK4或CDK6形成的复合物的抑制剂;另一类是P21家族，包括P21，P27和P57，他们是控制G1/S转换的CDK的抑制剂[4-5].
P27通过与各种cyclin-CDK复合物相互作用，从而抑制他们的活性，获得对细胞周期的调控.生理状态下，P27主要是通过与cyclinE-CDK2复合物的相互作用，从而调节细胞从G1后期到S期.目前认为P27是TGF-b、cAMP及其他细胞外因子诱导细胞生长停滞的主要递质[7].在正常情况下，p27Kip1在G0/G1期时表达增高，当细胞进入S期时则表达下降.虽然p27Kip1能广泛抑制各种周期蛋白和周期抑制蛋白(CDK)的活性，但主要抑制细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白D-CDK4等G1期激酶复合物，使细胞不能通过G1期[6].细胞凋亡多数发生于细胞周期的G1期、G1晚期或S期[8-9]，因此在G1晚期表达的蛋白如p27Kip1和p21Cip1无疑会参与凋亡的进程.我们以体外培养的人肝癌细胞系为靶细胞，以抑癌基因p27Kip1为目的基因，将构建的pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1真核表达质粒体外转染HHCC,用MTT、3H-TdR和克隆形成实验观察到抑癌基因p27Kip1对HHCC增生及其DNA合成均有明显抑制作用，抑制率约为56%.通过电子显微镜发现过表达的p27Kip1能够诱导HHCC细胞凋亡，即对细胞凋亡有促进作用，从而抑制肿瘤细胞的生长.关于p27kip1抑制肝癌细胞生长的机制还有待于进一步的探讨.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Polyak K, Lee MH, Erdjument-Bromage H, Koff A, Roberts JM, Tempst P, Massague J. Cloning of p27kip1, a
cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals. Cell 1994;78:59-66
2 Favrot M, Coll JL, Louis N, Negoescu A. Cell death and cancer: Replacement of apoptotic genes and inactivation of
death suppressor genes in therapy. Gene Ther 1998;5:728-739
, 百拇医药
3 Blagosklonny MV, Pardee AB. The restriction point of the cell cycle. Cell Cycle 2002;1:103-110
4 Nath N, Wang S, Betts V, Knudsen E, Chellappan S. Apoptotic and mitogenic stimuli inactivate Rb by differential
utilization of p38 and cyclin-dependent kinases. Oncogene 2003;22:5986-5994
5 Bryja V, Pachernik J, Faldikova L, Krejci P, Pogue R, Nevriva I, Dvorak P, Hampl A. The role of p27(Kip1) in maintaining
, http://www.100md.com
the levels of D-type cyclins in vivo. Biochim Biophys Acta 2004;1691:105-116
6 Shimizu T, Takahashi N, Tachibana K, Takeda K. Complex regulation of CDK2 and G1 arrest during neuronal
differentiation of human prostatic cancer TSU-Prl cells by staurosporine. Anticancer Res 2001;21:893-898
7 Kim TY, Kim WI, Smith RE, Kay ED. Role of p27(Kip1) in cAMP- and TGF-beta2-mediated antiproliferation in rabbit
, http://www.100md.com
corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:3142-3149
8 de Koning JP, Soede-Bobok AA, Ward AC, Schelen AM, Antonissen C, van Leeuwen D, Lowenberg B, Touw IP.
STAT3- mediated differentiation and survival and of myeloid cells in response to granulocyte colony-stimulating factor:
role for the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1). Oncogene 2000; 19:3290-3298
9 Alisi A, Leoni S, Piacentani A, Conti Devirgiliis L. Retinoic acid modulates the cell-cycle in fetal rat hepatocytes and
HepG2 cells by regulating cyclin-cdk activities. Liver Int 2003;23:179-186
编辑 张海宁, 百拇医药( 安家泽,董宏林, 窦科峰)
