丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响
吴亚云, 耿晓霞,程明亮,贵阳医学院附属医院感染科 贵州省贵阳市 550004
贵州省高层次人才基金资助项目, NO. 2003-1
通讯作者:程明亮, 550004, 贵州省贵阳市, 贵阳医学院附属医院感染科. gywuyy@21cn.com
电话: 0851-6855119-3193
收稿日期: 2005-01-17 接受日期: 2005-02-02
摘要
目的:探讨丹芍化纤方抗肝纤维化的作用机制.
, 百拇医药
方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法，分离、培养大鼠肝细胞，加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞，用MTT法测定肝细胞的增生，荧光实时定量PT-PCR(RealTime RT-PCR)法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达，并检测培养上清中的白蛋白.
结果:丹芍化纤方药物血清对肝细胞的增生及白蛋白合成有促进作用，能显著下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达，其表达水平与正常大鼠血清组比较有显著性差异，呈明显的浓度依赖关系.
结论:丹芍化纤方发挥抗肝纤维化作用与其促进肝细胞增生、蛋白合成功能，抑制肝细胞凋亡有关.
吴亚云,耿晓霞,程明亮.丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响.世界华人消化杂志 2005;13(6):781-783 (PDF) 丹芍化纤方药物血清对肝细胞增生的影响. aP<0.05，bP<0.01vs正常大鼠血清组.
, 百拇医药
图2 (PDF) 丹芍化纤方药物血清对肝细胞caspase-3mRNA的影响. cP<0.05vs正常大鼠血清组.
图3 (PDF) 丹芍化纤方药物血清对肝细胞合成白蛋白的影响. dP<0.05，eP<0.01vs正常大鼠血清组.
3 讨论
临床及动物实验研究虽已证明丹芍化纤方具有保护肝细胞和抗肝纤维化作用，由于体内研究受众多因素影响，不能准确反映药物对肝细胞的影响，肝细胞培养技术因可控制其外界环境的理化因素实现稳定条件下药物和其他作用的观察及检测而作为一种体外研究手段，越来越多地被应用于肝毒性物质的筛选、护肝药的活性鉴定、机制分析及病毒转染等研究.培养的肝细胞中如混有较多的间质细胞如枯否氏细胞、肝星状细胞，这些细胞贴壁后占据了大量的空间，肝细胞会因没有贴壁空间而死亡，因此，获取高纯度、高活力的肝细胞是体外实验成功的基础.我们在Seglen原位二步酶灌流法基础上联合Ficoll密度梯度离心方法分离肝细胞，其纯度98%以上，细胞活力达90%以上，确保了实验结果的准确性.
, 百拇医药
MTT是由活细胞线粒体内脱氢酶转化为难溶性的蓝紫色结晶物，转化量的多少反映活细胞的数量，可较好地用于细胞增生的测定，A值越高，细胞的增生越强.我们通过用MTT法对丹芍化纤方药物血清干预的体外培养正常大鼠肝细胞的增生进行测定，结果显示:丹芍化纤方药物血清较正常大鼠血清能显著地促进肝细胞的增生，血清浓度越高，对肝细胞增生的促进作用越强，呈浓度依赖关系，说明丹芍化纤方具有促进肝细胞再生作用，有助于肝损伤时肝细胞的修复.
细胞凋亡是在基因调控下细胞主动死亡的过程.在凋亡过程中的caspase联级反应中，caspase-3起效应性，是细胞凋亡中公共的下游效应因子，即凋亡下游的关键执行者，在细胞凋亡中扮演重要角色.激活的caspase-3可进一步切割各种蛋白底物蛋白使细胞最终走向死亡[8-9]，因此，检测细胞内caspase-3的变化可作为判断细胞凋亡干预措施是否有效的可靠指标，caspase-3mRNA的表达与细胞凋亡呈正相关，采用荧光实时定量PT-PCR定量检测caspase-3，可克服形态学方法不能精确定量、亦不能很好地区别细胞的凋亡和坏死，具有一定的假阳性等缺点[10].我们结果表明:随血清浓度增高，丹芍化纤方药物血清较正常大鼠血清能显著下调肝细胞caspase-3mRNA的表达，影响了蛋白酶的切割过程，进而防止肝细胞凋亡和坏死的发生，与整体动物实验结果一致[11].细胞凋亡过程中的caspase激活涉及两条途径，即细胞表面死亡受体途径及线粒体途径，有关丹芍化纤方是通过何种信号转导途径调控肝细胞凋亡，有待进一步研究.
, http://www.100md.com
白蛋白是肝细胞特异分泌的功能性蛋白，仅能由肝细胞合成.肝损害时，由于白蛋白的合成、细胞内运输和释放发生障碍，引起血清白蛋白减少，因此，血清白蛋白水平变化可反映肝实质损坏的程度.我们的结果显示:随丹芍化纤方药物血清浓度增高，肝细胞培养上清的白蛋白浓度增加，亦呈浓度依赖关系，与整体动物实验结果吻合[1]，提示丹芍化纤方具有促进肝细胞合成、分泌蛋白的能力.
总之，通过实验我们可以看出，，丹芍化纤方抗肝纤维化作用原因之一在于其具有促进肝细胞增生、合成功能，保护肝细胞、防止其凋亡、变性和坏死作用，减少了引起肝纤维化的启动刺激因素.
致谢:本实验细胞培养部分在贵阳医学院免疫与干细胞中心完成，得到左丽教授、赵星助教等同志的大力帮助，在此一并致谢!
4 参考文献
, 百拇医药
1 Friedman SL. Liver fibrosis-from bench to bedside. J Hepatol 2003;38(Suppl 1):S38-53
2 Canbay A, Friedman S, Gores GJ. Apoptosis:the nexus of liver injury and fibrosis. Hepatology 2004;39:273-278
3 张惠娜, 李诚秀, 黄能慧, 罗俊, 程明亮. 汉丹肝乐对免疫性肝纤维化的预防作用. 贵州医药 2001;25:415-417
4 Cheng ML, Lu YY,Wu J, Luo TY, Ding YS. Clincal study on reversing hepatic fibrosis withHandan Ganle capsule.
, 百拇医药
CJIM 2001;7:16-18
5 殷继东, 田德英, 黄巧新. 抗纤方对肝星状细胞活化增生、凋亡和基质金属蛋白酶-1及其抑制剂表达的影响.
中西医结合肝病杂志 2002;12:211-214
6 谢华福, 甘淋, 李娟, 刘晓燕, 宋杰, 李洪. 一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法.
泸洲医学院学报 2003;26:306-307
7 Liu W, Saint DA. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay
, 百拇医药 based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal Biochem 2002;302:52-59
8 Rust C, Gores GJ. Apoptosis and liver disease [J]. Am J Med 2000;108:567-574
9 张晓田. Caspase-3与细胞凋亡的研究. 医学综述 2002;8:621-623
10 张勇, 沈佰华, 余奇文, 马安伦, 李宁丽, 张冬青. 用荧光定量检测caspase-3的活性.
细胞与分子免疫学杂志 2001;17:188-190
11 罗新华, 杨勤, 程明亮, 李诚秀. 丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肝脏细胞凋亡与凋亡调控基因表达的影响.
贵州医药 2004;28:495-497
编辑 张海宁, 百拇医药
贵州省高层次人才基金资助项目, NO. 2003-1
通讯作者:程明亮, 550004, 贵州省贵阳市, 贵阳医学院附属医院感染科. gywuyy@21cn.com
电话: 0851-6855119-3193
收稿日期: 2005-01-17 接受日期: 2005-02-02
摘要
目的:探讨丹芍化纤方抗肝纤维化的作用机制.
, 百拇医药
方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法，分离、培养大鼠肝细胞，加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞，用MTT法测定肝细胞的增生，荧光实时定量PT-PCR(RealTime RT-PCR)法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达，并检测培养上清中的白蛋白.
结果:丹芍化纤方药物血清对肝细胞的增生及白蛋白合成有促进作用，能显著下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达，其表达水平与正常大鼠血清组比较有显著性差异，呈明显的浓度依赖关系.
结论:丹芍化纤方发挥抗肝纤维化作用与其促进肝细胞增生、蛋白合成功能，抑制肝细胞凋亡有关.
吴亚云,耿晓霞,程明亮.丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响.世界华人消化杂志 2005;13(6):781-783 (PDF) 丹芍化纤方药物血清对肝细胞增生的影响. aP<0.05，bP<0.01vs正常大鼠血清组.
, 百拇医药
图2 (PDF) 丹芍化纤方药物血清对肝细胞caspase-3mRNA的影响. cP<0.05vs正常大鼠血清组.
图3 (PDF) 丹芍化纤方药物血清对肝细胞合成白蛋白的影响. dP<0.05，eP<0.01vs正常大鼠血清组.
3 讨论
临床及动物实验研究虽已证明丹芍化纤方具有保护肝细胞和抗肝纤维化作用，由于体内研究受众多因素影响，不能准确反映药物对肝细胞的影响，肝细胞培养技术因可控制其外界环境的理化因素实现稳定条件下药物和其他作用的观察及检测而作为一种体外研究手段，越来越多地被应用于肝毒性物质的筛选、护肝药的活性鉴定、机制分析及病毒转染等研究.培养的肝细胞中如混有较多的间质细胞如枯否氏细胞、肝星状细胞，这些细胞贴壁后占据了大量的空间，肝细胞会因没有贴壁空间而死亡，因此，获取高纯度、高活力的肝细胞是体外实验成功的基础.我们在Seglen原位二步酶灌流法基础上联合Ficoll密度梯度离心方法分离肝细胞，其纯度98%以上，细胞活力达90%以上，确保了实验结果的准确性.
, 百拇医药
MTT是由活细胞线粒体内脱氢酶转化为难溶性的蓝紫色结晶物，转化量的多少反映活细胞的数量，可较好地用于细胞增生的测定，A值越高，细胞的增生越强.我们通过用MTT法对丹芍化纤方药物血清干预的体外培养正常大鼠肝细胞的增生进行测定，结果显示:丹芍化纤方药物血清较正常大鼠血清能显著地促进肝细胞的增生，血清浓度越高，对肝细胞增生的促进作用越强，呈浓度依赖关系，说明丹芍化纤方具有促进肝细胞再生作用，有助于肝损伤时肝细胞的修复.
细胞凋亡是在基因调控下细胞主动死亡的过程.在凋亡过程中的caspase联级反应中，caspase-3起效应性，是细胞凋亡中公共的下游效应因子，即凋亡下游的关键执行者，在细胞凋亡中扮演重要角色.激活的caspase-3可进一步切割各种蛋白底物蛋白使细胞最终走向死亡[8-9]，因此，检测细胞内caspase-3的变化可作为判断细胞凋亡干预措施是否有效的可靠指标，caspase-3mRNA的表达与细胞凋亡呈正相关，采用荧光实时定量PT-PCR定量检测caspase-3，可克服形态学方法不能精确定量、亦不能很好地区别细胞的凋亡和坏死，具有一定的假阳性等缺点[10].我们结果表明:随血清浓度增高，丹芍化纤方药物血清较正常大鼠血清能显著下调肝细胞caspase-3mRNA的表达，影响了蛋白酶的切割过程，进而防止肝细胞凋亡和坏死的发生，与整体动物实验结果一致[11].细胞凋亡过程中的caspase激活涉及两条途径，即细胞表面死亡受体途径及线粒体途径，有关丹芍化纤方是通过何种信号转导途径调控肝细胞凋亡，有待进一步研究.
, http://www.100md.com
白蛋白是肝细胞特异分泌的功能性蛋白，仅能由肝细胞合成.肝损害时，由于白蛋白的合成、细胞内运输和释放发生障碍，引起血清白蛋白减少，因此，血清白蛋白水平变化可反映肝实质损坏的程度.我们的结果显示:随丹芍化纤方药物血清浓度增高，肝细胞培养上清的白蛋白浓度增加，亦呈浓度依赖关系，与整体动物实验结果吻合[1]，提示丹芍化纤方具有促进肝细胞合成、分泌蛋白的能力.
总之，通过实验我们可以看出，，丹芍化纤方抗肝纤维化作用原因之一在于其具有促进肝细胞增生、合成功能，保护肝细胞、防止其凋亡、变性和坏死作用，减少了引起肝纤维化的启动刺激因素.
致谢:本实验细胞培养部分在贵阳医学院免疫与干细胞中心完成，得到左丽教授、赵星助教等同志的大力帮助，在此一并致谢!
4 参考文献
, 百拇医药
1 Friedman SL. Liver fibrosis-from bench to bedside. J Hepatol 2003;38(Suppl 1):S38-53
2 Canbay A, Friedman S, Gores GJ. Apoptosis:the nexus of liver injury and fibrosis. Hepatology 2004;39:273-278
3 张惠娜, 李诚秀, 黄能慧, 罗俊, 程明亮. 汉丹肝乐对免疫性肝纤维化的预防作用. 贵州医药 2001;25:415-417
4 Cheng ML, Lu YY,Wu J, Luo TY, Ding YS. Clincal study on reversing hepatic fibrosis withHandan Ganle capsule.
, 百拇医药
CJIM 2001;7:16-18
5 殷继东, 田德英, 黄巧新. 抗纤方对肝星状细胞活化增生、凋亡和基质金属蛋白酶-1及其抑制剂表达的影响.
中西医结合肝病杂志 2002;12:211-214
6 谢华福, 甘淋, 李娟, 刘晓燕, 宋杰, 李洪. 一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法.
泸洲医学院学报 2003;26:306-307
7 Liu W, Saint DA. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay
, 百拇医药 based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal Biochem 2002;302:52-59
8 Rust C, Gores GJ. Apoptosis and liver disease [J]. Am J Med 2000;108:567-574
9 张晓田. Caspase-3与细胞凋亡的研究. 医学综述 2002;8:621-623
10 张勇, 沈佰华, 余奇文, 马安伦, 李宁丽, 张冬青. 用荧光定量检测caspase-3的活性.
细胞与分子免疫学杂志 2001;17:188-190
11 罗新华, 杨勤, 程明亮, 李诚秀. 丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肝脏细胞凋亡与凋亡调控基因表达的影响.
贵州医药 2004;28:495-497
编辑 张海宁, 百拇医药
