共轭亚油酸的毒理学研究
【摘要】 目的 为了检验盐地碱蓬共轭亚油酸的生物安全性。方法 对共轭亚油酸样品进行小鼠急性毒性试验和小鼠遗传毒性试验。结果 小鼠急性和遗传毒性测试均为阴性。对大鼠喂养30日的试验表明，在试验期内各实验组动物生长发育良好，体重、食物利用率、血常规、血生化、脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异无显著性(P>0.05)。病理组织学检查也没有发现异常。结论 表明该物质对大鼠各项观察指标未产生明显毒性作用。
关键词 共轭亚油酸 毒理学
Investigation of the toxicology of conjugated linoleic acid
Shi Hongqi，Liu Fayi，Li Guangyou，et al.
First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao266061.
【Abstract】 Objective The mouse acute toxicity test and heredity toxicity test of conjugated linoleic acid(CLA)were investigated.Methods It is shown that all tests of acute and heredity toxicity are negative.Results The study of rats on30day feeding shows that the experimental groups have been in good state，and the body weight，food intake，haematological profile，viscera modulus have been in ordinary scope.There are no significant difference between test group and control group(P>0.05).Conclusion Results from this study indicate a lack of toxicity for CLA.
Key words conjugated linoleic acid toxicological evaluation
共轭亚油酸(conjugated linoleic cid，CLA)，是指一类亚油酸的位置和空间共轭二烯异构体，其中cis-9，trans-11和trans-10，cis-12异构体被认为具有生理活性。两种异构体都是天然产物，其中cis-9，trans-11CLA，是饮食来源CLA的主要形式。共轭亚油酸是存在于人和动物体内的一种营养物质，20世纪80年代后期，美国科学家在研究烤牛肉中的致癌物质时，偶然发现了一种具有抗癌变作用的物质，后来的研究进一步发现，其还具有、抗动脉硬化、抗氧化 [1～2] 、提高免疫力、增加骨骼密度、降低人和动物体脂肪、增加肌肉 [3～5] 等生理功能。由于这是一种天然存在于人和动物中的活性物质，最近十几年来国际上活性脂类研究方面最活跃的领域之一。国外研究表明，共轭亚油酸在一定剂量下对健康人是安全的 [6～7] 。将CLA产品开发为食品或药品，必须进行相关的毒理学评价。因此，本文开展CLA毒理学研究，以期为将CLA开发成为功能食品和药品提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 样品
液体共轭亚油酸，共轭亚油酸含量71.77%(c9t11CLA，34.14%;10c12CLA，34.07%;其他CLA，3.56%)，青岛澳海生物有限公司。共轭亚油酸标准品，sigma公司提供。
1.2 试验动物
二级昆明种小白鼠(医动字第01-3001号)，二级Wistar大鼠(医动字第01-3008号)。购自中国医学科学院医学试验动物研究所试验动物繁殖场。以小鼠为材料进行毒理学试验;以大鼠为材料进行生理生化试验。
1.3 剂量选择
依人体推荐剂量为0.1g·kg -1 ·d -1 为依据，设定各试验项目、各试验组的大、小鼠饲喂CLA量，分别为2.50、5.00、10.00g/kg，相当于人推荐量的25、50、100倍。用花生油将样品配制所需浓度，同时设立普通对照组和模型对照组(均灌花生油)，测各项指标。
1.4 试验方法
1.4.1 小鼠急性毒性试验
选择小鼠20只，雄性(♂)和雌性(♀)各10只，体重为18～22g。每天2次灌胃给予受试物，剂量为20g/kg，观察14天，记录动物中毒表现及死亡情况。
1.4.2 小鼠遗传毒性试验
1.4.2.1 艾姆斯(Ames)试验
试验菌株为鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，体外活化系统为多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆制备的S-9混合液。根据毒性测定结果，试验设250、500、2500、5000μg/皿，共5个剂量，同时设立自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组试剂分别为(1)疟的平，250μg/皿;(2)正丁霉素，50μg/皿;(3)叠氮钠，100μg/皿;(4)丝裂霉素，0.5μg/皿;(5)2-AF，50μg/皿。
1.4.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
选择体重25 ～30g小鼠50只，随机分为5组，雌雄各半。3个试验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg·bw，另设阴性对照组和阳性对照组(环磷酰胺，40mg/kg·bw)。采用间隔24h两次灌胃法试验，末次给予受试物后6h处死动物，常规制片。
1.4.2.3 小鼠精子畸形试验和精细胞染色体畸变试验
选择体重25～35g雄性小鼠50只，随机分为10组。6个试验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg，另设阴性对照组和阳性对照组(环磷酰胺，40mg/kg)。灌胃给予受试物，连续5天，首次灌胃后第35天处死动物，常规制片。3组试验组及相应对照组，每只动物记数1000个结构完整的精子，记录畸变类型和数量，计算精子畸形率(%)。另外3组试验组及相应对照组，每只动物记数100个精细胞中期分裂相，记录畸变类型和数量，计算染色体畸变率(%)。1.4.3 大鼠喂养试验(30天) 选用体重40～60g断乳大鼠80只，随机分为4组，雌雄各半。3个实验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg，将受试物每天经口灌胃给予实验动物。对照组饲喂基础饲料并同时灌胃给予葵花籽油。记录大鼠进食量、体重，连续观察30天。
大鼠试验观察和指标测定。观察大鼠的一般表现、体重、食物利用率(%)。血常规及生化指标;病理解剖:脏器系数、观察及病理组织检查。
1.5 统计学方法
用Foxprow软件建立数据库，用EPI软件进行数据分析。
2 结果
2.1 小鼠急性毒性测定结果
灌胃给予受试物后，两种性别的小鼠均未见明显中毒症状，14天内动物无死亡。因此 认为，该受试物对两种性别小鼠的急性毒性半致死浓度LD 50 均>20g/kg，见表1。根据急性毒性分级标准，该液体CLA属实际无毒物质。
表1 小鼠急性毒性结果(略)
2.2.1 Ames试验结果
第1次和第2次试验结果表明，受试物各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系见表2，说明在加与不加S-9时受试样品对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102等株试验菌株均未呈现遗传毒性。
表2 Ames试验结果 (略)
2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果
对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果见表3。表明，受试物各剂量组微核率与阴性对照组之间差异无显著性，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组之间差异有非常显著。表明，受试样品对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核未产生作用。
2.2.3 小鼠精子畸形和精细胞染色体畸变测定结果
对小鼠精子畸形测定结果见表4。可见，受试物各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组之间差异无显著性，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组之间差异有非常显著性。说明，该受试样品没有致小鼠精子畸形作用。对小鼠精细胞染色体畸变测定结果见表5。可见，受试物各剂量组与阴性对照组之间差异无显著性，而阳性对照组与阴性对照组之间差异有显著性。说明，该样品未对小鼠精细胞染色体畸变产生影响。
表3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果 (略)
表4 小鼠精子畸形试验结果(略)
表5 小鼠精细胞染色体畸变试验结果 (略)
2.3 大鼠喂养试验测定结果
2.3.1 大鼠的一般表现及体重、食物利用率测定结果
在大鼠喂养30天过程中，观察其行为，表明，大鼠未出现拒食现象，生长活动正常。体重和食物利用率测定结果说明，各试验组大鼠体重与对照组之间差异无显著性(P>0.05)，各雄性试验组大鼠体重增重较对照组明显降低。各试验组动物进食量、食物利用率同对照组之间差异亦无显著性(P>0.05)。说明受试样品对大鼠的影响除体重降低外，其它生理活动无异常。
2.3.2 大鼠血常规及生化指标测定结果
对大鼠血常规和生化指标测定结果表明，各试验组的血红蛋白、红细胞记数、白细胞计数及其分类、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白等指标均 在正常范围之内，与阴性对照组之间差异均无显著性。
2.3.3 大鼠组织病理学检查结果
喂养30天后的大鼠进行组织病理学检查结果表明，观察各试验组，未发现异常，解剖时亦未发现膀胱、肝总管结石，脏器系数未见异常。镜下观察对照组和各试验组动物的肝、脾、肾、十二肠、睾丸或卵巢等，均未见模型的病理改变。说明受试样品对大鼠内脏及其它组织均未造成病理改变。
3 讨论
对共轭亚油酸样品进行小鼠急性毒性试验、小鼠遗传毒性试验(Ames试验、骨髓嗜多染红细胞微核试验、精子畸形试验、睾丸染色体畸变试验)。结果表明，急性和遗传毒性测试均为阴性。对大鼠喂养30天的试验表明，内各试验组动物生长发育良好，体重、食物利用率、血常规、血生化、脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异无显著性。病理组织学检查也没有发现异常，表明该物质对大鼠各项观察指标未产生明显毒性作用。
Scimeca以大鼠为模型进行了36周试验，分别给予基础饲料，基础饲料加1.5%CLA。试验结果显示CLA未产生明显的毒性作用，持CLA进入GRAS(FDA基本认为安全)状态 [6] 。Berven研究了健康志愿者中共轭亚油酸(CLA)的安全性 [7] 。每天分别食用3.4g CLA或4.5g橄榄油。
两个试验组在异常事件和安全性指标差异无显著性，个体表现也差异无显著性。结果指出，受试剂量CLA对于健康人群是安全物质。
本研究表明，以人体推荐量的(0.1g/kg)的25～100倍的共轭亚油酸，喂养试验小鼠、大鼠均无明显毒性作用。为此，本研究结果为今后将CLA用于人类的保健或一些疑难病症的防治药物的开发研制，提供了科学依据。
参考文献
1 Ha YL，Crimmo NK，Pariza MW.Anticarcinogens from fried ground beef:heat-altered derivativesoflinoleicacid.Carcinogensis，1987，8(1):1881-1887.
2 Lee KN，Kritchevsky D，Pariza MW.Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits Atherosclerosis，1994，108(1):19-25.
3 Delany JP，Blohm F，Truett AA，et al.Conjugated linoleic acid rapidly reduces body fat content in mice without affecting energy intake.Am J Physiol，1999，276(4):1172-1179.
4 Miner JL，Cederberg CA，Nielsen，et al.Conjugated linoleic acid(CLA)，body fat，and apoptosis.Obesity Research，2001，9(2):129-134.
5 SiskMB，Hausman DB，Martin RJ，et al.Dietary conjugated linoleic acid reduces adiposity in lean but not obese zucker rats.J.Nutr，2001，131(6):1668-1674.
6 Scimeca JA.Toxicological evaluation of dietary conjugated linoleic acid in male Fischer344rats.Food and Chemical Toxicology，1998，36:391-395.
7 Berven G，Bye A，Hals O.Safety of conjugated linoleic acid(CLA)in overweight or obese human volunteers.European Journal of Lipid Sciˉence and Technology，2000，102(7):455-462.
作者单位:1266061青岛国家海洋局第一海洋研究所
2250014济南山东省卫生防疫站(编辑李 木), http://www.100md.com(石红旗 刘发义 李光友 谢 伟)
关键词 共轭亚油酸 毒理学
Investigation of the toxicology of conjugated linoleic acid
Shi Hongqi，Liu Fayi，Li Guangyou，et al.
First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao266061.
【Abstract】 Objective The mouse acute toxicity test and heredity toxicity test of conjugated linoleic acid(CLA)were investigated.Methods It is shown that all tests of acute and heredity toxicity are negative.Results The study of rats on30day feeding shows that the experimental groups have been in good state，and the body weight，food intake，haematological profile，viscera modulus have been in ordinary scope.There are no significant difference between test group and control group(P>0.05).Conclusion Results from this study indicate a lack of toxicity for CLA.
Key words conjugated linoleic acid toxicological evaluation
共轭亚油酸(conjugated linoleic cid，CLA)，是指一类亚油酸的位置和空间共轭二烯异构体，其中cis-9，trans-11和trans-10，cis-12异构体被认为具有生理活性。两种异构体都是天然产物，其中cis-9，trans-11CLA，是饮食来源CLA的主要形式。共轭亚油酸是存在于人和动物体内的一种营养物质，20世纪80年代后期，美国科学家在研究烤牛肉中的致癌物质时，偶然发现了一种具有抗癌变作用的物质，后来的研究进一步发现，其还具有、抗动脉硬化、抗氧化 [1～2] 、提高免疫力、增加骨骼密度、降低人和动物体脂肪、增加肌肉 [3～5] 等生理功能。由于这是一种天然存在于人和动物中的活性物质，最近十几年来国际上活性脂类研究方面最活跃的领域之一。国外研究表明，共轭亚油酸在一定剂量下对健康人是安全的 [6～7] 。将CLA产品开发为食品或药品，必须进行相关的毒理学评价。因此，本文开展CLA毒理学研究，以期为将CLA开发成为功能食品和药品提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 样品
液体共轭亚油酸，共轭亚油酸含量71.77%(c9t11CLA，34.14%;10c12CLA，34.07%;其他CLA，3.56%)，青岛澳海生物有限公司。共轭亚油酸标准品，sigma公司提供。
1.2 试验动物
二级昆明种小白鼠(医动字第01-3001号)，二级Wistar大鼠(医动字第01-3008号)。购自中国医学科学院医学试验动物研究所试验动物繁殖场。以小鼠为材料进行毒理学试验;以大鼠为材料进行生理生化试验。
1.3 剂量选择
依人体推荐剂量为0.1g·kg -1 ·d -1 为依据，设定各试验项目、各试验组的大、小鼠饲喂CLA量，分别为2.50、5.00、10.00g/kg，相当于人推荐量的25、50、100倍。用花生油将样品配制所需浓度，同时设立普通对照组和模型对照组(均灌花生油)，测各项指标。
1.4 试验方法
1.4.1 小鼠急性毒性试验
选择小鼠20只，雄性(♂)和雌性(♀)各10只，体重为18～22g。每天2次灌胃给予受试物，剂量为20g/kg，观察14天，记录动物中毒表现及死亡情况。
1.4.2 小鼠遗传毒性试验
1.4.2.1 艾姆斯(Ames)试验
试验菌株为鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，体外活化系统为多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆制备的S-9混合液。根据毒性测定结果，试验设250、500、2500、5000μg/皿，共5个剂量，同时设立自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组试剂分别为(1)疟的平，250μg/皿;(2)正丁霉素，50μg/皿;(3)叠氮钠，100μg/皿;(4)丝裂霉素，0.5μg/皿;(5)2-AF，50μg/皿。
1.4.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
选择体重25 ～30g小鼠50只，随机分为5组，雌雄各半。3个试验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg·bw，另设阴性对照组和阳性对照组(环磷酰胺，40mg/kg·bw)。采用间隔24h两次灌胃法试验，末次给予受试物后6h处死动物，常规制片。
1.4.2.3 小鼠精子畸形试验和精细胞染色体畸变试验
选择体重25～35g雄性小鼠50只，随机分为10组。6个试验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg，另设阴性对照组和阳性对照组(环磷酰胺，40mg/kg)。灌胃给予受试物，连续5天，首次灌胃后第35天处死动物，常规制片。3组试验组及相应对照组，每只动物记数1000个结构完整的精子，记录畸变类型和数量，计算精子畸形率(%)。另外3组试验组及相应对照组，每只动物记数100个精细胞中期分裂相，记录畸变类型和数量，计算染色体畸变率(%)。1.4.3 大鼠喂养试验(30天) 选用体重40～60g断乳大鼠80只，随机分为4组，雌雄各半。3个实验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg，将受试物每天经口灌胃给予实验动物。对照组饲喂基础饲料并同时灌胃给予葵花籽油。记录大鼠进食量、体重，连续观察30天。
大鼠试验观察和指标测定。观察大鼠的一般表现、体重、食物利用率(%)。血常规及生化指标;病理解剖:脏器系数、观察及病理组织检查。
1.5 统计学方法
用Foxprow软件建立数据库，用EPI软件进行数据分析。
2 结果
2.1 小鼠急性毒性测定结果
灌胃给予受试物后，两种性别的小鼠均未见明显中毒症状，14天内动物无死亡。因此 认为，该受试物对两种性别小鼠的急性毒性半致死浓度LD 50 均>20g/kg，见表1。根据急性毒性分级标准，该液体CLA属实际无毒物质。
表1 小鼠急性毒性结果(略)
2.2.1 Ames试验结果
第1次和第2次试验结果表明，受试物各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系见表2，说明在加与不加S-9时受试样品对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102等株试验菌株均未呈现遗传毒性。
表2 Ames试验结果 (略)
2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果
对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果见表3。表明，受试物各剂量组微核率与阴性对照组之间差异无显著性，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组之间差异有非常显著。表明，受试样品对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核未产生作用。
2.2.3 小鼠精子畸形和精细胞染色体畸变测定结果
对小鼠精子畸形测定结果见表4。可见，受试物各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组之间差异无显著性，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组之间差异有非常显著性。说明，该受试样品没有致小鼠精子畸形作用。对小鼠精细胞染色体畸变测定结果见表5。可见，受试物各剂量组与阴性对照组之间差异无显著性，而阳性对照组与阴性对照组之间差异有显著性。说明，该样品未对小鼠精细胞染色体畸变产生影响。
表3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果 (略)
表4 小鼠精子畸形试验结果(略)
表5 小鼠精细胞染色体畸变试验结果 (略)
2.3 大鼠喂养试验测定结果
2.3.1 大鼠的一般表现及体重、食物利用率测定结果
在大鼠喂养30天过程中，观察其行为，表明，大鼠未出现拒食现象，生长活动正常。体重和食物利用率测定结果说明，各试验组大鼠体重与对照组之间差异无显著性(P>0.05)，各雄性试验组大鼠体重增重较对照组明显降低。各试验组动物进食量、食物利用率同对照组之间差异亦无显著性(P>0.05)。说明受试样品对大鼠的影响除体重降低外，其它生理活动无异常。
2.3.2 大鼠血常规及生化指标测定结果
对大鼠血常规和生化指标测定结果表明，各试验组的血红蛋白、红细胞记数、白细胞计数及其分类、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白等指标均 在正常范围之内，与阴性对照组之间差异均无显著性。
2.3.3 大鼠组织病理学检查结果
喂养30天后的大鼠进行组织病理学检查结果表明，观察各试验组，未发现异常，解剖时亦未发现膀胱、肝总管结石，脏器系数未见异常。镜下观察对照组和各试验组动物的肝、脾、肾、十二肠、睾丸或卵巢等，均未见模型的病理改变。说明受试样品对大鼠内脏及其它组织均未造成病理改变。
3 讨论
对共轭亚油酸样品进行小鼠急性毒性试验、小鼠遗传毒性试验(Ames试验、骨髓嗜多染红细胞微核试验、精子畸形试验、睾丸染色体畸变试验)。结果表明，急性和遗传毒性测试均为阴性。对大鼠喂养30天的试验表明，内各试验组动物生长发育良好，体重、食物利用率、血常规、血生化、脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异无显著性。病理组织学检查也没有发现异常，表明该物质对大鼠各项观察指标未产生明显毒性作用。
Scimeca以大鼠为模型进行了36周试验，分别给予基础饲料，基础饲料加1.5%CLA。试验结果显示CLA未产生明显的毒性作用，持CLA进入GRAS(FDA基本认为安全)状态 [6] 。Berven研究了健康志愿者中共轭亚油酸(CLA)的安全性 [7] 。每天分别食用3.4g CLA或4.5g橄榄油。
两个试验组在异常事件和安全性指标差异无显著性，个体表现也差异无显著性。结果指出，受试剂量CLA对于健康人群是安全物质。
本研究表明，以人体推荐量的(0.1g/kg)的25～100倍的共轭亚油酸，喂养试验小鼠、大鼠均无明显毒性作用。为此，本研究结果为今后将CLA用于人类的保健或一些疑难病症的防治药物的开发研制，提供了科学依据。
参考文献
1 Ha YL，Crimmo NK，Pariza MW.Anticarcinogens from fried ground beef:heat-altered derivativesoflinoleicacid.Carcinogensis，1987，8(1):1881-1887.
2 Lee KN，Kritchevsky D，Pariza MW.Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits Atherosclerosis，1994，108(1):19-25.
3 Delany JP，Blohm F，Truett AA，et al.Conjugated linoleic acid rapidly reduces body fat content in mice without affecting energy intake.Am J Physiol，1999，276(4):1172-1179.
4 Miner JL，Cederberg CA，Nielsen，et al.Conjugated linoleic acid(CLA)，body fat，and apoptosis.Obesity Research，2001，9(2):129-134.
5 SiskMB，Hausman DB，Martin RJ，et al.Dietary conjugated linoleic acid reduces adiposity in lean but not obese zucker rats.J.Nutr，2001，131(6):1668-1674.
6 Scimeca JA.Toxicological evaluation of dietary conjugated linoleic acid in male Fischer344rats.Food and Chemical Toxicology，1998，36:391-395.
7 Berven G，Bye A，Hals O.Safety of conjugated linoleic acid(CLA)in overweight or obese human volunteers.European Journal of Lipid Sciˉence and Technology，2000，102(7):455-462.
作者单位:1266061青岛国家海洋局第一海洋研究所
2250014济南山东省卫生防疫站(编辑李 木), http://www.100md.com(石红旗 刘发义 李光友 谢 伟)