角膜移植患者外周血T细胞及其亚群CD 25 分子表达研究
【摘要】 目的 观察角膜移植患者外周血T细胞及其亚群CD 25 分子的表达。方法 应用流式细胞仪于手术前1天、术后第1、2、3、8周检测23例角膜移植患者外周血T细胞CD 25 分子表达。结果 角膜高血管化植床组患者术后外周血T细胞CD 25 分子表达比角膜无血管化植床组患者明显增高，也比术前明显增高(P<0.01)，6例发生过排斥反应的患者均在高血管化植床组，早期外周血中以CD +4 T细胞为主。结论 外周血T细胞CD 25 分子表达与角膜移植排斥反应密切相关，测定外周血中CD 25 分子表达可更早预见排斥反应的发生。
角膜移植是治疗角膜疾病的有效手术，其失败的最主要原因是术后免疫排斥反应。据临床统计，在无血管植床者，排斥反应的发生率为5%～10%。而在高血管化植床或二次移植者，排斥反应发生率高达50% [1] 。CD 25 是IL-2Ra，自1979年BONNARD等人从体外培养的CTC(Human cultured T cell)上发现以来，对CD 25 进行了深入研究，证实CD 25 是促进T细胞活化的关键。最近又发现小鼠和人CD +4 CD +25 T细胞具有免疫调节功能 [2～5] ，但其作用机制尚未清楚。本文应用流式细胞仪检测角膜移植患者外周血T细胞CD 25 分子表达，分析CD 25 分子与排斥反应的相关性。
1 资料与方法
1.1 研究对象 23例部分穿透性角膜移植患者，其中男9人，女14人，年龄16～56岁。基本上排除了自身免疫性疾病、糖尿病和眼部葡萄膜炎。
1.2 实验分组 依据角膜临床条件将患者分为两组:无血管植床组，8例;高血管化植床组，角膜有较多浅层或深层新生血管，15例。
1.3 手术方法及术后处理 手术按临床上常规穿透性角膜移植步骤进行，环钻直径7.0～8.0mm，10-0尼龙线作连续或间断缝合。术后常规全身和局部使用地塞米松和抗生素，术后3～6个月拆线。发生排斥反应时，激素用量加大。
1.4 术后观察 术后依据眼部睫状充血，角膜上皮、基质和内皮排斥线，角膜水肿和KP等体征判断有无发生排斥反应。分别与手术前1天，术后第1、2、3、8周从前臂静脉抽1ml肝素抗凝血，用于T细胞CD 25 分子表达测定。
1.5 T细胞CD 25 分子表达标记分析 小鼠抗人荧光标记单克隆抗体Anti-CD 3 ·FITC、anti-CD 4 ·FITC、anti-CD 3 ·FITC，小鼠抗人anti-CD 25 和羊抗小鼠anti-IgG·PE购自美国BDIS公司。对外周血采用双色荧光单克隆抗体标记，全部数据应用流式细胞仪(FAC star puls.美国)和软件LysysⅡ进行分析。
2 结果
2.1 在半年观察期内，有6例患者发生了免疫排斥反应，均发生在高血管化植床组，其中4例经激素治疗后治愈，2例植片变混浊。
2.2 术前无血管化植床患者或高血管化植床患者外周血T细胞CD 25 分子表达分别为15.2%和16.1%。术后两组患者外周血T细胞CD 25 分子表达均有不同程度的升高，但以高血管化植床患者增高明显，见表1、图1。术后同时期比较，高血管化植床患者外周血CD 25 分子表达明显高于无血管化植床患者(P<0.01)，术后第3周差异最大。术后高血管化患者CD 25 分子表达较术前也明显升高。
表1 角膜移植患者外周血T细胞CD 25 分子表达 (略)
2.3 对术后第3周数据分析，无血管化植床和高血管化植床患者外周血不同亚群T细胞CD 25 分子表达分别为:在CD +3 群体，分别为16.3%和27.4%;在CD +4 群体，分别为9.3%和18.6%;在CD +8 群体，分别为7.8%和8.3%，在CD +3 群体或CD +4 群体，两组之间差异有显著性，其中以CD +4 群体差异最明显，见表2。
表2 角膜移植患者术后第3周外周血T细胞不同群体CD 25 分子表达 (略)
3 讨论
在免疫系统中，T细胞为最重要的免疫细胞之一，排斥反应主要是T细胞介导的免疫应答。T细胞活化是免疫应答的早期环节，因此，T细胞活化指标也倍受关注。近年来，在肾脏、心脏及肝脏等器官移植领域 [6～8] ，发现移植器官稳定状态和排斥反应的发生与外周血T细胞CD 25 分子表达存在相关性。白细胞介素2受体是由α、β、γ三条链组成的糖蛋白，CD 25 分子即白细胞介素2受体α链。T细胞活化必须有IL-2和IL-2R的结合才能启动。静止成熟的T淋巴细胞未发现功能性表达CD 25 分子，即使受抗原或有丝分裂原刺激后表达CD 25 分子，但仍需不断刺激才能维持。因而，CD 25 分子被认为是激活T淋巴细胞的标志。从本文的研究结果，6例术后发生排斥反应的患者均为高血管化植床，其外周血T细胞CD 25 分子表达明显升高。上述结果可以显示外周血T细胞CD 25 分子表达与角膜移植排斥反应密切相关。
关于T细胞亚群在角膜移植排斥反应中所起作用尚无统一认识，多数作者从局部浸润的结果表明以CD +8 细胞浸润为主 [9] ，但也有作者发现以CD +4 细胞浸润为主。从本研究结果显示，术后早期外周血中CD +4 细胞活化最为明显，我们认为免疫应答早期活化是CD +4 细胞为主，而效应期可能是以CD +8 细胞为主，CD +4 可以诱导CD +8 活化，这与Sako等研究结果相似。
同种移植的排斥反应由T细胞通过特异的T细胞受体识别移植物的非己组织相容性抗原所启动，导致移植物的排斥和破坏，这一过程中不同亚群T细胞发挥不同的作用 [10] 。其中CD +4 CD +25 T细胞具有独特的作用方式和功能特征，1995年由Sakaguchi等首次报道后即引起广泛关注。Chiffoleau等应用药 物治疗MHC完全不合的心脏移植耐受小鼠模型，证实了CD +4 CD +25 T细胞的存在。Cobbold等也提出CD +4 CD +25 T细胞是
诱发移植耐受的主要细胞。近年研究表明:CD +4 、CD +25 T细胞具有强大的免疫抑制作用，CD +4 CD +25 T细胞的免疫抑制性表现在经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD 4 和CD 8 T细胞的活化和增殖 [4] 。本研究测定角膜移植术后外周血T细胞CD +4 CD +25 亚群的结果亦可证实:表达CD 25 的T细胞与IL-2相互作用为T细胞的克隆扩增提供了增殖信号，在移植反应中起着重要作用。
如今对自身免疫病、器官移植和肿瘤免疫的研究都涉及了免疫调节的问题，CD +4 CD +25 T细胞的研究在对自身免疫病的预防和治疗中有很好的应用前景 [11] 。角膜移植术后进行免疫学监测是为了能更早预见排斥反应的发生，以便及时采取治疗，防止其发生和发展。目前临床上尚无客观灵敏的监测方法。近年来，有报道测定血清中sIL-2R [12] ，但sIL-2R容易受手术本身和CMV感染等因素影响。而CD 25 是T细胞激活较早表达的分子，它本身即是一个免疫系统活化的激动因子，又是细胞毒T细胞赖以发挥效应不可缺少的效应因子。它的表达是辅助性T细胞(Th)活化和细胞免疫反应启动的重要标志。从本研究结果，我们认为:CD 25 分子表达可以客观反应T细胞活化状态，测定外周血中T细胞CD 25 分子表达可以作为角膜移植术后有效的免疫监测方法。并且本试验应用流式细胞仪结合单克隆抗体技术，结果较为客观灵敏。
(本文图片略)
参考文献
1 Shevach E A.Regulatory T cells in autoimmunity.Annu Rev Immunol，2000，18:423.
2 Seddon B D，Mason.The third function of the thymus.Immunol Today，2000，21:95.
3 Detlef D，Heidi P，Susanni B，et al.Ex vivo isolation and characterizaˉtion of CD +4 CD +25 T cells with regulatory properties from human blood.J Exp Med，2001，193:1303.
4 高晓明，鲁琰.CD +4 CD +25 调节性T细胞的研究现状及展望.细胞与分子免疫学杂志，2002，18(3):201.
5 Foulks GN.Beneficial effects of histocompatibility in high risk corneal transplantation.Am J Ophthtalol，1982，94:622.
6 Bouchot O.Interleukin-2receptor in rat heart allograft.Transplantation，1989，48:918.
7 Zucchel GC.Increased circulating concentration of interlerkin2recep-torduring rejection episodes in heart-or-kidney-transplant recipient.Cli Chem，1990，36:2106.
8 李晓春.大鼠肝表面移植脾片细胞免疫学研究.肝胆胰外科杂志，2001，13:1.
9 贾战生.T淋巴细胞亚群在同种移植排斥中的作用.上海免疫学杂志，1990，10:319.
10 Shirwan H，Barwari L，Khan NS.Predominant expression of T helper2cytokines and altered expression of T helper1cytokines in long-term allograft survival induced by intrathymic immune modulation with donor class I major histocompatibility complex peptides.Transplantation， 1998，6
6(12):1802-1809.
11 Green EA，Choi Y，Flavell RA.Pancreatic lymph node-derived CD +4+25 T reg cells:highly potent regulators of diabetes that require TRANCE-RANK signals.Immunity，2002，16(2):183-191.
12 毕可红.白细胞介素2受体与移植排斥反应.上海免疫学杂志，1994，14:125.
基金项目:广东省科技厅基金资助项目[粤科基984182]
作者单位:510632广东省广州市暨南大学附属第一医院眼科
(收稿日期:2004-08-02)
(编辑晓 亮), 百拇医药(钟敬祥 徐锦堂 刘莲 朱春玲 赵伟)
角膜移植是治疗角膜疾病的有效手术，其失败的最主要原因是术后免疫排斥反应。据临床统计，在无血管植床者，排斥反应的发生率为5%～10%。而在高血管化植床或二次移植者，排斥反应发生率高达50% [1] 。CD 25 是IL-2Ra，自1979年BONNARD等人从体外培养的CTC(Human cultured T cell)上发现以来，对CD 25 进行了深入研究，证实CD 25 是促进T细胞活化的关键。最近又发现小鼠和人CD +4 CD +25 T细胞具有免疫调节功能 [2～5] ，但其作用机制尚未清楚。本文应用流式细胞仪检测角膜移植患者外周血T细胞CD 25 分子表达，分析CD 25 分子与排斥反应的相关性。
1 资料与方法
1.1 研究对象 23例部分穿透性角膜移植患者，其中男9人，女14人，年龄16～56岁。基本上排除了自身免疫性疾病、糖尿病和眼部葡萄膜炎。
1.2 实验分组 依据角膜临床条件将患者分为两组:无血管植床组，8例;高血管化植床组，角膜有较多浅层或深层新生血管，15例。
1.3 手术方法及术后处理 手术按临床上常规穿透性角膜移植步骤进行，环钻直径7.0～8.0mm，10-0尼龙线作连续或间断缝合。术后常规全身和局部使用地塞米松和抗生素，术后3～6个月拆线。发生排斥反应时，激素用量加大。
1.4 术后观察 术后依据眼部睫状充血，角膜上皮、基质和内皮排斥线，角膜水肿和KP等体征判断有无发生排斥反应。分别与手术前1天，术后第1、2、3、8周从前臂静脉抽1ml肝素抗凝血，用于T细胞CD 25 分子表达测定。
1.5 T细胞CD 25 分子表达标记分析 小鼠抗人荧光标记单克隆抗体Anti-CD 3 ·FITC、anti-CD 4 ·FITC、anti-CD 3 ·FITC，小鼠抗人anti-CD 25 和羊抗小鼠anti-IgG·PE购自美国BDIS公司。对外周血采用双色荧光单克隆抗体标记，全部数据应用流式细胞仪(FAC star puls.美国)和软件LysysⅡ进行分析。
2 结果
2.1 在半年观察期内，有6例患者发生了免疫排斥反应，均发生在高血管化植床组，其中4例经激素治疗后治愈，2例植片变混浊。
2.2 术前无血管化植床患者或高血管化植床患者外周血T细胞CD 25 分子表达分别为15.2%和16.1%。术后两组患者外周血T细胞CD 25 分子表达均有不同程度的升高，但以高血管化植床患者增高明显，见表1、图1。术后同时期比较，高血管化植床患者外周血CD 25 分子表达明显高于无血管化植床患者(P<0.01)，术后第3周差异最大。术后高血管化患者CD 25 分子表达较术前也明显升高。
表1 角膜移植患者外周血T细胞CD 25 分子表达 (略)
2.3 对术后第3周数据分析，无血管化植床和高血管化植床患者外周血不同亚群T细胞CD 25 分子表达分别为:在CD +3 群体，分别为16.3%和27.4%;在CD +4 群体，分别为9.3%和18.6%;在CD +8 群体，分别为7.8%和8.3%，在CD +3 群体或CD +4 群体，两组之间差异有显著性，其中以CD +4 群体差异最明显，见表2。
表2 角膜移植患者术后第3周外周血T细胞不同群体CD 25 分子表达 (略)
3 讨论
在免疫系统中，T细胞为最重要的免疫细胞之一，排斥反应主要是T细胞介导的免疫应答。T细胞活化是免疫应答的早期环节，因此，T细胞活化指标也倍受关注。近年来，在肾脏、心脏及肝脏等器官移植领域 [6～8] ，发现移植器官稳定状态和排斥反应的发生与外周血T细胞CD 25 分子表达存在相关性。白细胞介素2受体是由α、β、γ三条链组成的糖蛋白，CD 25 分子即白细胞介素2受体α链。T细胞活化必须有IL-2和IL-2R的结合才能启动。静止成熟的T淋巴细胞未发现功能性表达CD 25 分子，即使受抗原或有丝分裂原刺激后表达CD 25 分子，但仍需不断刺激才能维持。因而，CD 25 分子被认为是激活T淋巴细胞的标志。从本文的研究结果，6例术后发生排斥反应的患者均为高血管化植床，其外周血T细胞CD 25 分子表达明显升高。上述结果可以显示外周血T细胞CD 25 分子表达与角膜移植排斥反应密切相关。
关于T细胞亚群在角膜移植排斥反应中所起作用尚无统一认识，多数作者从局部浸润的结果表明以CD +8 细胞浸润为主 [9] ，但也有作者发现以CD +4 细胞浸润为主。从本研究结果显示，术后早期外周血中CD +4 细胞活化最为明显，我们认为免疫应答早期活化是CD +4 细胞为主，而效应期可能是以CD +8 细胞为主，CD +4 可以诱导CD +8 活化，这与Sako等研究结果相似。
同种移植的排斥反应由T细胞通过特异的T细胞受体识别移植物的非己组织相容性抗原所启动，导致移植物的排斥和破坏，这一过程中不同亚群T细胞发挥不同的作用 [10] 。其中CD +4 CD +25 T细胞具有独特的作用方式和功能特征，1995年由Sakaguchi等首次报道后即引起广泛关注。Chiffoleau等应用药 物治疗MHC完全不合的心脏移植耐受小鼠模型，证实了CD +4 CD +25 T细胞的存在。Cobbold等也提出CD +4 CD +25 T细胞是
诱发移植耐受的主要细胞。近年研究表明:CD +4 、CD +25 T细胞具有强大的免疫抑制作用，CD +4 CD +25 T细胞的免疫抑制性表现在经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD 4 和CD 8 T细胞的活化和增殖 [4] 。本研究测定角膜移植术后外周血T细胞CD +4 CD +25 亚群的结果亦可证实:表达CD 25 的T细胞与IL-2相互作用为T细胞的克隆扩增提供了增殖信号，在移植反应中起着重要作用。
如今对自身免疫病、器官移植和肿瘤免疫的研究都涉及了免疫调节的问题，CD +4 CD +25 T细胞的研究在对自身免疫病的预防和治疗中有很好的应用前景 [11] 。角膜移植术后进行免疫学监测是为了能更早预见排斥反应的发生，以便及时采取治疗，防止其发生和发展。目前临床上尚无客观灵敏的监测方法。近年来，有报道测定血清中sIL-2R [12] ，但sIL-2R容易受手术本身和CMV感染等因素影响。而CD 25 是T细胞激活较早表达的分子，它本身即是一个免疫系统活化的激动因子，又是细胞毒T细胞赖以发挥效应不可缺少的效应因子。它的表达是辅助性T细胞(Th)活化和细胞免疫反应启动的重要标志。从本研究结果，我们认为:CD 25 分子表达可以客观反应T细胞活化状态，测定外周血中T细胞CD 25 分子表达可以作为角膜移植术后有效的免疫监测方法。并且本试验应用流式细胞仪结合单克隆抗体技术，结果较为客观灵敏。
(本文图片略)
参考文献
1 Shevach E A.Regulatory T cells in autoimmunity.Annu Rev Immunol，2000，18:423.
2 Seddon B D，Mason.The third function of the thymus.Immunol Today，2000，21:95.
3 Detlef D，Heidi P，Susanni B，et al.Ex vivo isolation and characterizaˉtion of CD +4 CD +25 T cells with regulatory properties from human blood.J Exp Med，2001，193:1303.
4 高晓明，鲁琰.CD +4 CD +25 调节性T细胞的研究现状及展望.细胞与分子免疫学杂志，2002，18(3):201.
5 Foulks GN.Beneficial effects of histocompatibility in high risk corneal transplantation.Am J Ophthtalol，1982，94:622.
6 Bouchot O.Interleukin-2receptor in rat heart allograft.Transplantation，1989，48:918.
7 Zucchel GC.Increased circulating concentration of interlerkin2recep-torduring rejection episodes in heart-or-kidney-transplant recipient.Cli Chem，1990，36:2106.
8 李晓春.大鼠肝表面移植脾片细胞免疫学研究.肝胆胰外科杂志，2001，13:1.
9 贾战生.T淋巴细胞亚群在同种移植排斥中的作用.上海免疫学杂志，1990，10:319.
10 Shirwan H，Barwari L，Khan NS.Predominant expression of T helper2cytokines and altered expression of T helper1cytokines in long-term allograft survival induced by intrathymic immune modulation with donor class I major histocompatibility complex peptides.Transplantation， 1998，6
6(12):1802-1809.
11 Green EA，Choi Y，Flavell RA.Pancreatic lymph node-derived CD +4+25 T reg cells:highly potent regulators of diabetes that require TRANCE-RANK signals.Immunity，2002，16(2):183-191.
12 毕可红.白细胞介素2受体与移植排斥反应.上海免疫学杂志，1994，14:125.
基金项目:广东省科技厅基金资助项目[粤科基984182]
作者单位:510632广东省广州市暨南大学附属第一医院眼科
(收稿日期:2004-08-02)
(编辑晓 亮), 百拇医药(钟敬祥 徐锦堂 刘莲 朱春玲 赵伟)