水泡性口腔炎病毒增殖的初步探讨
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邱淑华 欧泽惠 孙 明
自1957年Isaacs和Lindenmann发现干扰素至今，已有许多干扰素活性测定方法问世。目前国内外各型干扰素效价测定中，皆乐于使用水泡性口腔炎病毒(VSV)作为攻击病毒(1)，在本实验室，我们用鸡胚细胞进行VSV的增殖，用TCID50微量滴定法测定其效价，增殖的11批VSV病毒效价多在1000～10000之间，且比较稳定，现报告如下。
1 材料、方法与结果
1.1 材料：用于开始阶段增殖的VSV毒株由贵州省防疫站惠赠；人羊膜细胞wish株为中国药品生物制品检定所提供；日本产Eagle´s培基；小牛血清由成都生物制品检定所提供；九日龄鸡胚(自孵)；胰酶为新疆化研所生化厂提供。
1.2 方法：(1)VSV的增殖：选取九日龄生长良好、血管清晰鸡胚，碘酒消毒气室，去壳，取出鸡胚，去头、内脏，Eagle´s洗二次，置小烧杯中，剪刀剪碎，加0.25%胰酶，37℃水浴，倒掉上层液，加Eagle´s液，轻摇，去上层液，如此重复2～3次，加少量含10%小牛血清Eagle´s液，用自制大口平头吸管吹打鸡胚，见培基混浊，加含10%小牛血清Eagle´s液，轻摇，将上层液纱布过滤收集于一大瓶中，再加少量含10%小牛血清Eagle´s液，吹打，过滤收集上层液，如此重复3～4次，至鸡胚细胞几乎全部被吹打分散，集中收集的上层液滤液中，加含10%小牛血清Eagle´s液适量，分瓶，37℃培养24～48h，使其长成良好的细胞厚层，按1∶200稀释增殖用VSV，接种于鸡胚厚层细胞中，37℃培养至细胞病变呈+++～++++时，取出，放置于-20℃冰箱，待测。(2)VSV效价测定：用TCID50微量滴定法，滴定所用细胞为人羊膜细胞wish株，具体操作如下：微量板上将wish细胞培养成单层，甩去孔中液体，将-20℃冻存的VSV取出，融化，吹打，集中，混匀取样。用含5%小牛血清Eagle´s液对样品做连续10倍稀释，每个稀释度做2孔，每孔加样0.1ml，同时做空白对照，以每孔细胞半数病变的稀释度为1个TCID50单位，此稀释度的倒数乘以10倍即为病毒的效价(TCID50/ml)。
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1.3 结果：增殖的11批VSV，批号分别为881030、881204、890331、890512、891009、900226、900306、901008、901203、930208、930306，效价分别为1000、1000、10000、10000、10000、100、10000、1000、1000、1000、1000。
2 讨论
2.1 从11批VSV效价测定结果可见，我们增殖的、VSV效价多在1000～10000之间，较为稳定，但在实验后期，我们繁殖的VSV效价稍低，这可能是繁殖周期较短，产生DI颗粒，而DI颗粒产生自身干扰所至，所以，在进行VSV增殖时，传代毒种稀释度要大于1∶200，以减少DI颗粒的自身干扰，同时，要增大鸡胚量，使周期延长，减少传代次数，以稳定VSV效价。
2.2 在鸡胚细胞病变为+++～++++时收获VSV，因VSV对温度比较敏感，而此时病毒生存繁殖所需的鸡胚细胞极少，毒力下降极快，37℃、4.6h，效价降低一半，12h后几乎完全失活(2)，所以，要及时收获VSV。
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2.3 在实验中，我们用15ml吸管自制成大口平头状，吹打分散鸡胚细胞时，其分散效果好，操作简便、实用。同时，对测定干扰素效价所需的VSV在增殖测定其效价时，全部小量分装至青霉素小瓶中，-20℃保存，按需取用，方便、节约，效价损失小，对留做传代毒株的，放液氮保存。
作者单位：邱淑华 欧泽惠 贵州省血液中心
孙 明 贵州省卫生防疫站
参考文献
1 杜 平.医用干扰素学，北京：解放军出版社，1985：224～226
2 伊 林，曲秀君.应用改良法连续增殖VSV.中国输血杂志 1996；9(4)：195
广西医学
GUANGXI MEDICAL JOURNAL
1999年 第21卷 第5期 Vol.21 No.5 1999, 百拇医药
自1957年Isaacs和Lindenmann发现干扰素至今，已有许多干扰素活性测定方法问世。目前国内外各型干扰素效价测定中，皆乐于使用水泡性口腔炎病毒(VSV)作为攻击病毒(1)，在本实验室，我们用鸡胚细胞进行VSV的增殖，用TCID50微量滴定法测定其效价，增殖的11批VSV病毒效价多在1000～10000之间，且比较稳定，现报告如下。
1 材料、方法与结果
1.1 材料：用于开始阶段增殖的VSV毒株由贵州省防疫站惠赠；人羊膜细胞wish株为中国药品生物制品检定所提供；日本产Eagle´s培基；小牛血清由成都生物制品检定所提供；九日龄鸡胚(自孵)；胰酶为新疆化研所生化厂提供。
1.2 方法：(1)VSV的增殖：选取九日龄生长良好、血管清晰鸡胚，碘酒消毒气室，去壳，取出鸡胚，去头、内脏，Eagle´s洗二次，置小烧杯中，剪刀剪碎，加0.25%胰酶，37℃水浴，倒掉上层液，加Eagle´s液，轻摇，去上层液，如此重复2～3次，加少量含10%小牛血清Eagle´s液，用自制大口平头吸管吹打鸡胚，见培基混浊，加含10%小牛血清Eagle´s液，轻摇，将上层液纱布过滤收集于一大瓶中，再加少量含10%小牛血清Eagle´s液，吹打，过滤收集上层液，如此重复3～4次，至鸡胚细胞几乎全部被吹打分散，集中收集的上层液滤液中，加含10%小牛血清Eagle´s液适量，分瓶，37℃培养24～48h，使其长成良好的细胞厚层，按1∶200稀释增殖用VSV，接种于鸡胚厚层细胞中，37℃培养至细胞病变呈+++～++++时，取出，放置于-20℃冰箱，待测。(2)VSV效价测定：用TCID50微量滴定法，滴定所用细胞为人羊膜细胞wish株，具体操作如下：微量板上将wish细胞培养成单层，甩去孔中液体，将-20℃冻存的VSV取出，融化，吹打，集中，混匀取样。用含5%小牛血清Eagle´s液对样品做连续10倍稀释，每个稀释度做2孔，每孔加样0.1ml，同时做空白对照，以每孔细胞半数病变的稀释度为1个TCID50单位，此稀释度的倒数乘以10倍即为病毒的效价(TCID50/ml)。
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1.3 结果：增殖的11批VSV，批号分别为881030、881204、890331、890512、891009、900226、900306、901008、901203、930208、930306，效价分别为1000、1000、10000、10000、10000、100、10000、1000、1000、1000、1000。
2 讨论
2.1 从11批VSV效价测定结果可见，我们增殖的、VSV效价多在1000～10000之间，较为稳定，但在实验后期，我们繁殖的VSV效价稍低，这可能是繁殖周期较短，产生DI颗粒，而DI颗粒产生自身干扰所至，所以，在进行VSV增殖时，传代毒种稀释度要大于1∶200，以减少DI颗粒的自身干扰，同时，要增大鸡胚量，使周期延长，减少传代次数，以稳定VSV效价。
2.2 在鸡胚细胞病变为+++～++++时收获VSV，因VSV对温度比较敏感，而此时病毒生存繁殖所需的鸡胚细胞极少，毒力下降极快，37℃、4.6h，效价降低一半，12h后几乎完全失活(2)，所以，要及时收获VSV。
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2.3 在实验中，我们用15ml吸管自制成大口平头状，吹打分散鸡胚细胞时，其分散效果好，操作简便、实用。同时，对测定干扰素效价所需的VSV在增殖测定其效价时，全部小量分装至青霉素小瓶中，-20℃保存，按需取用，方便、节约，效价损失小，对留做传代毒株的，放液氮保存。
作者单位：邱淑华 欧泽惠 贵州省血液中心
孙 明 贵州省卫生防疫站
参考文献
1 杜 平.医用干扰素学，北京：解放军出版社，1985：224～226
2 伊 林，曲秀君.应用改良法连续增殖VSV.中国输血杂志 1996；9(4)：195
广西医学
GUANGXI MEDICAL JOURNAL
1999年 第21卷 第5期 Vol.21 No.5 1999, 百拇医药