高压氧对脑缺血致记忆障碍大鼠脑内钙分布及生长抑素含量的影响
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王伯平 于涛 孙长丰 冯增文 贾钢锐
关键词：高压氧；脑缺血；大鼠；脑；钙；生长抑素
材料和方法
成年雄性健康SD大鼠30只，体重250～300 g，由北京中国医学科学院动物研究所提供。随机分为3组，包括正常不缺血高压氧(HBO)作用组(对照组)，缺血后HBO未作用组(模型组)，缺血HBO作用组(HBO组)。
动物模型制备：用0.5%氯胺酮(0.3 ml/100 g Wt.I.P)腹腔内注射。先头顶部正中切口，暴露第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm电凝针插入每一侧翼小孔中，烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞，缝合创口，避光保温饲养。24 h 后，再暴露双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min，反复3次，每次间隔1 h，恢复供血，缝合创口饲养。对照组手术后步骤同上，但不做脑缺血处理。
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动物学习、记忆训练及测试：动物模型制作前，首先对所有动物进行水迷宫和跳台试验的训练及测试，每天训练5～7次，连续5 d，同时记录成绩。水迷宫及跳台仪由中国医学科学院药物所提供。
病理观察：快速将动物断头处死，迅速取额、颞叶皮质，将组织切成1～2 mm3的组织块，置于0～4℃的3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾溶液中，固定2 h。用7.5%蔗糖-90 mmol/L草酸钾溶液振荡浸洗3次，1%OS4，2%焦锑酸钾溶液室温下固定1 h。经过脱水、浸透与包埋后，超薄切片，日本H 500型电镜下观察，放大倍数为10 000～60 000。
部分脑区标本的生长抑素(SS)测定：快速断头取全脑，置沸腾生理盐水中煮5 min后，分离海马、丘脑等脑区，称重后，移入含1 NHCl 1 ml的匀浆管内充分匀浆，室温搁置100 min，再加入1 ml 1NNaOH，3 000r/min离心20 min取上清液置入-80℃冰箱内保存待测。用上海第二军医大学神经生物学教研室提供的SS放射性核素测定试剂盒进行检测。HBO动物实验舱由全军航海病专科中心提供。将对照组和治疗组大鼠同时放入动物舱内，用纯氧加压至0.18 MPa，然后减压，连续洗舱3次，再用纯氧加压至0.25 MPa，持续吸氧90 min，20 min匀速减压出舱。每天1次，10次1个疗程，共2个疗程。两个疗程间隔5 d。每个疗程结束后，立即进行学习、记忆能力的测试。
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统计学处理：对所测数据取均值(X±s)，用方差分析判断差异程度。
结果
水迷宫试验结果：缺血后30 d，模型组动物在水迷宫中游全程的时间比对照组明显延长(F＝4.09，P<0.05)，进入盲端的错误次数比对照组明显增多(F＝4.37，P<0.05)。经HBO治疗后，HBO组大鼠游全程的时间比模型组有明显缩短(F＝3.74，P<0.05)。进入盲端的错误次数比模型组明显减少(F＝3.89，P<0.05)，见表1，2。
跳台试验结果：缺血后30 d模型组动物在跳台试验中的潜伏期比对照组明显缩短(F＝4.86，P<0.05)，错误次数比对照组明显增多(F＝4.58，P<0.05)。经HBO治疗后HBO组动物错误次数比模型组有明显减少(F＝3.66，P<0.05)，见表3。
电镜所见：模型组动物额、颞叶皮质神经元和胶质细胞的核膜结构不清，线粒体明显肿胀，内质网扩张并脱颗粒，胞质出现空泡。并见钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，钙颗粒增多的程度与细胞损伤程度相符(图略)，经HBO治疗后，HBO组动物皮质神经元和胶质细胞的结构正常，核膜结构清晰，胞质内粗面内质网丰富(图略)。
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部分脑区标本SS测定结果：模型组海马区SS含量与HBO组比较明显减少(F＝3.91，P<0.05)，而丘脑区SS含量与HBO组差异无显著性(F＝2.86，P>0.05)。
表1 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中游全程的时间(X±s，s，n＝10)
组别及时间 测 试 时 间
第1 d 第2 d 第3 d 第4 d
实验前 对照组 53.0± 5.9 47.9±10.1 51.0± 9.5 41.9± 6.4
模型组 33.2± 7.3 49.5±10.9 44.5± 7.0 40.5± 7.9
HBO组 46.5± 8.3 46.2±11.0 32.7± 6.2 45.2± 7.7
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缺血30 d对照组 44.8± 8.1 41.2±11.3 40.0± 7.5 41.2± 5.6
模型组 89.3±16.5 88.2±13.7 79.4±13.8 82.4±14.0
HBO组 117.5±14.8 98.2±17.8 86.3±12.2 80.8±14.4
HBO-2个疗程对照组 38.7±13.3 44.9±13.0 40.5± 6.7 38.9± 7.2
模型组 43.1± 8.6 50.0±22.9 34.4±13.6 26.6±12.2
HBO组 111.3±13.1 108.2±14.5 81.2±14.9 97.6±14.2
表2 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中错误次数(X±s，s,n＝10)
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组别及时间 测 试 时 间
第1 d 第2 d 第3 d 第4 d
实验前 对照组 2.2±0.3 2.8±0.6 2.7±0.5 1.9±0.3
模型组 1.9±0.3 2.1±0.4 2.3±0.3 1.8±0.4
HBO组 2.3±0.2 2.0±0.3 2.3±0.5 2.3±0.5
缺血30 d对照组 1.8±0.3 2.5±0.5 2.2±0.4 2.8±0.5
模型组 3.8±0.8 4.6±0.7 5.0±1.0 5.6±0.8
HBO组 6.8±1.4 5.1±0.8 5.6±0.8 5.9±1.0
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HBO-2个疗程对照组 2.3±0.5 2.3±0.5 2.3±0.7 3.2±0.6
模型组 5.9±1.3 5.9±1.3 5.0±1.0 5.5±0.8
HBO组 2.1±0.7 2.1±0.7 2.4±0.8 2.0±0.8
表3 HBO作用前后大鼠在跳台试验中学习记忆成绩(X±s，s,n＝10)
组别及时间 第1 d测试 第2 d测试 第3 d测试
潜伏期(s) 错误次数 潜伏期(s) 错误次数 潜伏期(s) 错误次数
实验前 对照组 22.1±17.6 3.6±0.7 164.0±16.0 0.4±0.4 151.5±19.0 0.4±0.3
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模型组 23.7±17.4 2.9±0.7 149.0±20.8 0.2±0.1 146.0±22.7 0.3±0.2
HBO组 25.6±17.2 3.1±0.8 133.0±24.0 0.7±0.4 150.7±19.9 0.2±0.1
缺血30 d对照组 125.4±22.8 0.4±0.2 146.4±22.4 0.2±0.1 164.1±15.9 0.1±0.1
模型组 35.5±16.5 3.0±0.9 25.4±17.2 1.5±0.3 56.5±21.3 1.3±0.4
HBO组 76.7±28.1 1.2±0.5 65.0±25.1 1.6±0.5 77.9±23.0 1.1±0.4
HBO-2个疗程对照组 170.5± 9.5 0.2±0.2 145.8±22.9 0.4±0.3 145.8±0.20 0.2±0.1
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模型组 69.9±24.1 3.3±0.8 64.7±25.3 2.0±0.6 84.6±0.82 2.3±0.8
HBO组 92.3±31.2 1.1±0.7 61.3±30.8 0.9±0.3 65.1±0.71 0.8±0.2
讨论
本实验采用Pulsinelli、贾健民等的方法[1，2]，建立大鼠反复脑缺血致学习记忆障碍的动物模型。实验证明，经过反复脑缺血再灌注后，模型组大鼠的学习记忆能力较对照组发生明显障碍(P<0.05)，与文献报道相符[2]。反复脑缺血再灌注后第30 d神经元超微结构仍有明显损伤，钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，主要由于缺氧使钙泵运转停止、钙通道开放引起细胞内钙超载[3]。SS与认知功能有关，可能参与知觉和智能高级神经活动。已有实验证明，中枢胆碱能系统破坏后，脑内SS含量明显减少[4]。本研究证明，反复脑缺血再灌注后，模型组动物海马区SS的含量比对照组动物明显减少(P<0.05)。学习记忆障碍可能与此有关。HBO作用后，SS的含量明显提高。
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经HBO作用后，HBO组大鼠学习记忆能力比模型组有显著提高(P<0.05)。神经元超微结构损伤明显改善。海马区SS的含量比模型组动物明显改变(P<0.05)。结果提示：高压氧对脑缺血所致学习、记忆障碍有一定作用，但临床上要掌握治疗时机，尽早进行，且疗程要长。
王伯平(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
于涛(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
孙长丰(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
冯增文(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
贾钢锐(266071 青岛，解放军第四一医院神经科), http://www.100md.com
关键词：高压氧；脑缺血；大鼠；脑；钙；生长抑素
材料和方法
成年雄性健康SD大鼠30只，体重250～300 g，由北京中国医学科学院动物研究所提供。随机分为3组，包括正常不缺血高压氧(HBO)作用组(对照组)，缺血后HBO未作用组(模型组)，缺血HBO作用组(HBO组)。
动物模型制备：用0.5%氯胺酮(0.3 ml/100 g Wt.I.P)腹腔内注射。先头顶部正中切口，暴露第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm电凝针插入每一侧翼小孔中，烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞，缝合创口，避光保温饲养。24 h 后，再暴露双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min，反复3次，每次间隔1 h，恢复供血，缝合创口饲养。对照组手术后步骤同上，但不做脑缺血处理。
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动物学习、记忆训练及测试：动物模型制作前，首先对所有动物进行水迷宫和跳台试验的训练及测试，每天训练5～7次，连续5 d，同时记录成绩。水迷宫及跳台仪由中国医学科学院药物所提供。
病理观察：快速将动物断头处死，迅速取额、颞叶皮质，将组织切成1～2 mm3的组织块，置于0～4℃的3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾溶液中，固定2 h。用7.5%蔗糖-90 mmol/L草酸钾溶液振荡浸洗3次，1%OS4，2%焦锑酸钾溶液室温下固定1 h。经过脱水、浸透与包埋后，超薄切片，日本H 500型电镜下观察，放大倍数为10 000～60 000。
部分脑区标本的生长抑素(SS)测定：快速断头取全脑，置沸腾生理盐水中煮5 min后，分离海马、丘脑等脑区，称重后，移入含1 NHCl 1 ml的匀浆管内充分匀浆，室温搁置100 min，再加入1 ml 1NNaOH，3 000r/min离心20 min取上清液置入-80℃冰箱内保存待测。用上海第二军医大学神经生物学教研室提供的SS放射性核素测定试剂盒进行检测。HBO动物实验舱由全军航海病专科中心提供。将对照组和治疗组大鼠同时放入动物舱内，用纯氧加压至0.18 MPa，然后减压，连续洗舱3次，再用纯氧加压至0.25 MPa，持续吸氧90 min，20 min匀速减压出舱。每天1次，10次1个疗程，共2个疗程。两个疗程间隔5 d。每个疗程结束后，立即进行学习、记忆能力的测试。
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统计学处理：对所测数据取均值(X±s)，用方差分析判断差异程度。
结果
水迷宫试验结果：缺血后30 d，模型组动物在水迷宫中游全程的时间比对照组明显延长(F＝4.09，P<0.05)，进入盲端的错误次数比对照组明显增多(F＝4.37，P<0.05)。经HBO治疗后，HBO组大鼠游全程的时间比模型组有明显缩短(F＝3.74，P<0.05)。进入盲端的错误次数比模型组明显减少(F＝3.89，P<0.05)，见表1，2。
跳台试验结果：缺血后30 d模型组动物在跳台试验中的潜伏期比对照组明显缩短(F＝4.86，P<0.05)，错误次数比对照组明显增多(F＝4.58，P<0.05)。经HBO治疗后HBO组动物错误次数比模型组有明显减少(F＝3.66，P<0.05)，见表3。
电镜所见：模型组动物额、颞叶皮质神经元和胶质细胞的核膜结构不清，线粒体明显肿胀，内质网扩张并脱颗粒，胞质出现空泡。并见钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，钙颗粒增多的程度与细胞损伤程度相符(图略)，经HBO治疗后，HBO组动物皮质神经元和胶质细胞的结构正常，核膜结构清晰，胞质内粗面内质网丰富(图略)。
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部分脑区标本SS测定结果：模型组海马区SS含量与HBO组比较明显减少(F＝3.91，P<0.05)，而丘脑区SS含量与HBO组差异无显著性(F＝2.86，P>0.05)。
表1 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中游全程的时间(X±s，s，n＝10)
组别及时间 测 试 时 间
第1 d 第2 d 第3 d 第4 d
实验前 对照组 53.0± 5.9 47.9±10.1 51.0± 9.5 41.9± 6.4
模型组 33.2± 7.3 49.5±10.9 44.5± 7.0 40.5± 7.9
HBO组 46.5± 8.3 46.2±11.0 32.7± 6.2 45.2± 7.7
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缺血30 d对照组 44.8± 8.1 41.2±11.3 40.0± 7.5 41.2± 5.6
模型组 89.3±16.5 88.2±13.7 79.4±13.8 82.4±14.0
HBO组 117.5±14.8 98.2±17.8 86.3±12.2 80.8±14.4
HBO-2个疗程对照组 38.7±13.3 44.9±13.0 40.5± 6.7 38.9± 7.2
模型组 43.1± 8.6 50.0±22.9 34.4±13.6 26.6±12.2
HBO组 111.3±13.1 108.2±14.5 81.2±14.9 97.6±14.2
表2 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中错误次数(X±s，s,n＝10)
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组别及时间 测 试 时 间
第1 d 第2 d 第3 d 第4 d
实验前 对照组 2.2±0.3 2.8±0.6 2.7±0.5 1.9±0.3
模型组 1.9±0.3 2.1±0.4 2.3±0.3 1.8±0.4
HBO组 2.3±0.2 2.0±0.3 2.3±0.5 2.3±0.5
缺血30 d对照组 1.8±0.3 2.5±0.5 2.2±0.4 2.8±0.5
模型组 3.8±0.8 4.6±0.7 5.0±1.0 5.6±0.8
HBO组 6.8±1.4 5.1±0.8 5.6±0.8 5.9±1.0
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HBO-2个疗程对照组 2.3±0.5 2.3±0.5 2.3±0.7 3.2±0.6
模型组 5.9±1.3 5.9±1.3 5.0±1.0 5.5±0.8
HBO组 2.1±0.7 2.1±0.7 2.4±0.8 2.0±0.8
表3 HBO作用前后大鼠在跳台试验中学习记忆成绩(X±s，s,n＝10)
组别及时间 第1 d测试 第2 d测试 第3 d测试
潜伏期(s) 错误次数 潜伏期(s) 错误次数 潜伏期(s) 错误次数
实验前 对照组 22.1±17.6 3.6±0.7 164.0±16.0 0.4±0.4 151.5±19.0 0.4±0.3
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模型组 23.7±17.4 2.9±0.7 149.0±20.8 0.2±0.1 146.0±22.7 0.3±0.2
HBO组 25.6±17.2 3.1±0.8 133.0±24.0 0.7±0.4 150.7±19.9 0.2±0.1
缺血30 d对照组 125.4±22.8 0.4±0.2 146.4±22.4 0.2±0.1 164.1±15.9 0.1±0.1
模型组 35.5±16.5 3.0±0.9 25.4±17.2 1.5±0.3 56.5±21.3 1.3±0.4
HBO组 76.7±28.1 1.2±0.5 65.0±25.1 1.6±0.5 77.9±23.0 1.1±0.4
HBO-2个疗程对照组 170.5± 9.5 0.2±0.2 145.8±22.9 0.4±0.3 145.8±0.20 0.2±0.1
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模型组 69.9±24.1 3.3±0.8 64.7±25.3 2.0±0.6 84.6±0.82 2.3±0.8
HBO组 92.3±31.2 1.1±0.7 61.3±30.8 0.9±0.3 65.1±0.71 0.8±0.2
讨论
本实验采用Pulsinelli、贾健民等的方法[1，2]，建立大鼠反复脑缺血致学习记忆障碍的动物模型。实验证明，经过反复脑缺血再灌注后，模型组大鼠的学习记忆能力较对照组发生明显障碍(P<0.05)，与文献报道相符[2]。反复脑缺血再灌注后第30 d神经元超微结构仍有明显损伤，钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，主要由于缺氧使钙泵运转停止、钙通道开放引起细胞内钙超载[3]。SS与认知功能有关，可能参与知觉和智能高级神经活动。已有实验证明，中枢胆碱能系统破坏后，脑内SS含量明显减少[4]。本研究证明，反复脑缺血再灌注后，模型组动物海马区SS的含量比对照组动物明显减少(P<0.05)。学习记忆障碍可能与此有关。HBO作用后，SS的含量明显提高。
, http://www.100md.com
经HBO作用后，HBO组大鼠学习记忆能力比模型组有显著提高(P<0.05)。神经元超微结构损伤明显改善。海马区SS的含量比模型组动物明显改变(P<0.05)。结果提示：高压氧对脑缺血所致学习、记忆障碍有一定作用，但临床上要掌握治疗时机，尽早进行，且疗程要长。
王伯平(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
于涛(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
孙长丰(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
冯增文(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
贾钢锐(266071 青岛，解放军第四一医院神经科), http://www.100md.com