激素性股骨头坏死氧自由基代谢的实验观察
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陕西中医学院附属医院(咸阳 712083)
王国毓 姚永东 杨毓华 李堪印
朱长庚 李彦民 刘德玉
提要 为了探讨激素性股骨头缺血性坏死的发生机制，采用硫代巴比妥(TBA)比色法和邻苯三酚法检测激素性股骨头缺血坏死动物的红细胞SOD活性和血浆LPO含量，结果显示实验性动物红细胞SOD活性明显下降，血浆LPO含量明显升高，P<0.01。认为氧自由基代谢紊乱是导致激素性股骨头坏死的可能原因之一。
主题词 激素性股骨头坏死/病理学 氧自由基/血液 SOD活性/血液 LPO/血液实验研究 动物 兔
中图分类号：R289·5 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)01-0010-02
, 百拇医药
作者简介 王国毓，男，1967年生。1996年毕业于陕西中医学院研究生班，获骨伤专业硕士学位，现任陕西中医学院附属医院骨伤科主治医师，主要从事中医中西医结合骨伤科临床和科研工作，致力于股骨头坏死等疑难症的研究。已发表学术论文10余篇。
近年来，随着自由基生物学的发展，氧自由基在生物体内的产生及其对生物体的作用愈来愈为人们所认识。现认为氧自由基对生物体有强大的破坏作用，其与人体许多疾病的发生发展有关[1,2]。而氧自由基在激素性股骨头坏死发病机制中的作用，尚未见报道。本文采用肌注氢化考的松造成激素性股骨头坏死动物模型，用硫代巴比妥(TBA)比色法和邻苯三酚法测定了激素性股骨头坏死模型家兔红细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力和血浆脂质过氧化物(LPO)的含量。并与空白组作对照，旨在探讨自由基在激素性股骨头坏死发病过程中的作用。
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1 材料和方法
1.1 动物分组和造模方法 取4～6月龄健康日本大耳白兔24只，随机分为A、B两组。A组10只为空白对照组，B组14只为模型组。采用贺西京[3]等报告的方法造模，B组每周2次肌肉注射醋酚氧化考的松，每次8mg·kg-1；A组每周2次肌肉注射生理盐水，每次0.32mg·kg1，连续注射8周共16次。为预防感染，24只动物每周2次肌肉注射青霉素钠，每次每只5万单位。
1.2 红细胞SOD活力测定 第8周结束时，参考丁克祥等[4]的方法检测红细胞SOD活力。方法是采集动物血50ml，加入盛有生理盐水的离心管中，离心沉淀，并除上清液，加入冷蒸馏水0.2ml混匀，加95%乙醇0.1ml，振荡30秒后，加入三氯甲烷0.1ml，置于液体快速混合器中，抽提1分钟，然后以每分钟4000r的速度离心3分钟。此时液体分为3层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白(Hb)沉淀物，下层为三氯甲烷。记录上清液体积，按邻苯三酚法，用T21型分光光度计测定SOD的活力。
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1.3 血浆LPO含量的测定 应用硫代巴比妥酸(TBA)法测定血浆LPO含量〔5〕。方法是取兔血浆0.3ml，加入0.05mol·L-1盐酸溶液中，混匀加入0.67%TBA 1mol混匀，加盖，95℃水温加热30min后取出，流水冷却至室温，加甲醇正丁醇滴4ml振荡混匀。每分钟4000r离心10分钟，取上清液用T21型分光光度计比色取波长为536nm， 以正丁醇调零。测出吸光度A1。同样操作求出标准管的吸光度A2，用下述公式计算(MDA)含量，所测得的MDA含量即为LPO的含量。
MDA(nmol·ml-1)=测定管吸光度A1/标准管吸光度A2×10nmol·ml-1
2 实验结果
第8周时SOD活力与LPO含量检测结果(见附表)显示实验组SOD活力显著低于空白对照组(P<0.01)。实验组LPO含量显著高于空白对照组(P<0.01)。
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3 讨 论
所谓自由基是生物体内氧多不饱和脂肪酸、疏基化合物或类醌化合物的反应和代谢过程中产生或衍生出来的[6]。氧自由基包括超氧阴离子(O2-·)、单线态氧(1O2)羟自由基(OH·)等。它们都是引发脂质过氧化自由基反应的氧化剂，在正常情况下，由于生物体内存在自由基清除剂如SOD、过氧化氢酶等使生物体内自由基的产生与清除保持相对平衡，并参与许多正常的生理生化反应。若自由基清除剂的合成恶性化或自由基反应发生紊乱，则导致机体一系列的病理改变[7]。
SOD作为体内主要的自由基清除剂，能催化超氧化物，H2O2及脂质过氧化物的还原，控制脂质过氧化物的水平。SOD的减少，体内脂质过氧化物(LPO)的氧化和还原失控。现已知，脂质过氧化作用，可使结缔组织中的胶原纤维发生关联，使胶原蛋白相互联成大分子物质，使胶原蛋白僵硬，失去弹位[8]。而氧自由基还造成Ⅱ型胶原蛋白的氧化损伤，导致氨基酸含量及胶原蛋白的构象改变[7]。SOD的减少，清除自由基的功能下降，而使自由基的含量增大，脂质过氧化物的氧化和还原失控。现已知自由基对细胞的损害主要表现在以下几个方面：①脂质过氧化反应可使细胞膜受到破坏，从而影响细胞膜的功能；②脂质过氧化过程中可产生多种活泼的自由基，攻击细胞中的酶和染色体；③脂质过氧化反应中的醛类物质，对细胞有毒；④自由基可以使蛋白变性及影响酶活性[1]；⑤氧自由基对软骨细胞的DNA、蛋白多糖、胶原合成有明显的损害作用[8]。
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本实验结果表明，实验组大剂量摄入激素第8周时，动物红细胞SOD活力明显降低，血浆LPO含量明显升高。与空白对照组相比有较显著的差异(P<0.01)。由于SOD活力降低，动物体内自由基含量增多，已知自由基对蛋白质、核酸、酶类有直接损伤作用，从而引起细胞内损伤，因此自由基可以损伤骨细胞的蛋白质、核酸及酶类影响胶原的合成。同时自由基也可诱发脂质还氧化物酶链反应，产生脂氢化氧化物酶，损伤骨细胞膜线粒体，溶酶体和微体，而使骨细胞死亡，在微循环中，自由基使血管内皮胶原和基膜中的透明质酸产生不可逆性降解。这种作用的结果是激活细胞趋化性，使血小板和颗粒细胞聚集，做为炎症反应的一部分，聚集的颗粒细胞又可释放出更多的自由基，更加损伤血管内皮细胞，使血管壁的通透性增加，导致组织水肿、缺血、缺氧〔9〕。从本试验的结果得出自由基代谢失常，是导致激素性股骨头缺血性坏死的可能原因之一。
4 参考文献
1 莫简，吕问，孙淑芳。医用自由基生物学导论。北京：人民卫生出版社，1989；93～160
, 百拇医药
2 Delmasetro RF.Rudiculs as medintors of tissue ingurg .Acta physiol Seand 1980；492：543
3 贺西京，毛履真，王坤正，等。肾上腺糖皮质激素引起股骨头缺血坏死的机制实验研究。中华骨科杂志 1992；12(6)：442
4 丁克祥，钟水先，姚树人。微量脂血超氧化物歧化酶快速测定法的研究。老年医学 1987；7(2)：42
5 魏明竟，血浆过氧化脂质的测定及其临床意义。国外医学·临床生物化学与检验学分册 1984；5(1)：6
6 邵洪。自由基与蛋白质代谢。国外医学·分子生物学分册 1990；12：42
7 张德治。自由基在大骨节病病理过程中的作用。北京医科大学学报1990；22：59
8 朱杰，魏西秦，张健，氧自由基对人胚胎软骨细胞DNA及基质成分合成的抑制作用。中华外科杂志 31(9)：561～563
9 Rusell RC。再灌注损伤和氧自由基。国外医学·创伤与外科基本问题 1989；10(4)：209
(1998-11-22收稿 1999-03-02修回)
《中医正骨》, 百拇医药
王国毓 姚永东 杨毓华 李堪印
朱长庚 李彦民 刘德玉
提要 为了探讨激素性股骨头缺血性坏死的发生机制，采用硫代巴比妥(TBA)比色法和邻苯三酚法检测激素性股骨头缺血坏死动物的红细胞SOD活性和血浆LPO含量，结果显示实验性动物红细胞SOD活性明显下降，血浆LPO含量明显升高，P<0.01。认为氧自由基代谢紊乱是导致激素性股骨头坏死的可能原因之一。
主题词 激素性股骨头坏死/病理学 氧自由基/血液 SOD活性/血液 LPO/血液实验研究 动物 兔
中图分类号：R289·5 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)01-0010-02
, 百拇医药
作者简介 王国毓，男，1967年生。1996年毕业于陕西中医学院研究生班，获骨伤专业硕士学位，现任陕西中医学院附属医院骨伤科主治医师，主要从事中医中西医结合骨伤科临床和科研工作，致力于股骨头坏死等疑难症的研究。已发表学术论文10余篇。
近年来，随着自由基生物学的发展，氧自由基在生物体内的产生及其对生物体的作用愈来愈为人们所认识。现认为氧自由基对生物体有强大的破坏作用，其与人体许多疾病的发生发展有关[1,2]。而氧自由基在激素性股骨头坏死发病机制中的作用，尚未见报道。本文采用肌注氢化考的松造成激素性股骨头坏死动物模型，用硫代巴比妥(TBA)比色法和邻苯三酚法测定了激素性股骨头坏死模型家兔红细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力和血浆脂质过氧化物(LPO)的含量。并与空白组作对照，旨在探讨自由基在激素性股骨头坏死发病过程中的作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物分组和造模方法 取4～6月龄健康日本大耳白兔24只，随机分为A、B两组。A组10只为空白对照组，B组14只为模型组。采用贺西京[3]等报告的方法造模，B组每周2次肌肉注射醋酚氧化考的松，每次8mg·kg-1；A组每周2次肌肉注射生理盐水，每次0.32mg·kg1，连续注射8周共16次。为预防感染，24只动物每周2次肌肉注射青霉素钠，每次每只5万单位。
1.2 红细胞SOD活力测定 第8周结束时，参考丁克祥等[4]的方法检测红细胞SOD活力。方法是采集动物血50ml，加入盛有生理盐水的离心管中，离心沉淀，并除上清液，加入冷蒸馏水0.2ml混匀，加95%乙醇0.1ml，振荡30秒后，加入三氯甲烷0.1ml，置于液体快速混合器中，抽提1分钟，然后以每分钟4000r的速度离心3分钟。此时液体分为3层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白(Hb)沉淀物，下层为三氯甲烷。记录上清液体积，按邻苯三酚法，用T21型分光光度计测定SOD的活力。
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1.3 血浆LPO含量的测定 应用硫代巴比妥酸(TBA)法测定血浆LPO含量〔5〕。方法是取兔血浆0.3ml，加入0.05mol·L-1盐酸溶液中，混匀加入0.67%TBA 1mol混匀，加盖，95℃水温加热30min后取出，流水冷却至室温，加甲醇正丁醇滴4ml振荡混匀。每分钟4000r离心10分钟，取上清液用T21型分光光度计比色取波长为536nm， 以正丁醇调零。测出吸光度A1。同样操作求出标准管的吸光度A2，用下述公式计算(MDA)含量，所测得的MDA含量即为LPO的含量。
MDA(nmol·ml-1)=测定管吸光度A1/标准管吸光度A2×10nmol·ml-1
2 实验结果
第8周时SOD活力与LPO含量检测结果(见附表)显示实验组SOD活力显著低于空白对照组(P<0.01)。实验组LPO含量显著高于空白对照组(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨 论
所谓自由基是生物体内氧多不饱和脂肪酸、疏基化合物或类醌化合物的反应和代谢过程中产生或衍生出来的[6]。氧自由基包括超氧阴离子(O2-·)、单线态氧(1O2)羟自由基(OH·)等。它们都是引发脂质过氧化自由基反应的氧化剂，在正常情况下，由于生物体内存在自由基清除剂如SOD、过氧化氢酶等使生物体内自由基的产生与清除保持相对平衡，并参与许多正常的生理生化反应。若自由基清除剂的合成恶性化或自由基反应发生紊乱，则导致机体一系列的病理改变[7]。
SOD作为体内主要的自由基清除剂，能催化超氧化物，H2O2及脂质过氧化物的还原，控制脂质过氧化物的水平。SOD的减少，体内脂质过氧化物(LPO)的氧化和还原失控。现已知，脂质过氧化作用，可使结缔组织中的胶原纤维发生关联，使胶原蛋白相互联成大分子物质，使胶原蛋白僵硬，失去弹位[8]。而氧自由基还造成Ⅱ型胶原蛋白的氧化损伤，导致氨基酸含量及胶原蛋白的构象改变[7]。SOD的减少，清除自由基的功能下降，而使自由基的含量增大，脂质过氧化物的氧化和还原失控。现已知自由基对细胞的损害主要表现在以下几个方面：①脂质过氧化反应可使细胞膜受到破坏，从而影响细胞膜的功能；②脂质过氧化过程中可产生多种活泼的自由基，攻击细胞中的酶和染色体；③脂质过氧化反应中的醛类物质，对细胞有毒；④自由基可以使蛋白变性及影响酶活性[1]；⑤氧自由基对软骨细胞的DNA、蛋白多糖、胶原合成有明显的损害作用[8]。
, 百拇医药
本实验结果表明，实验组大剂量摄入激素第8周时，动物红细胞SOD活力明显降低，血浆LPO含量明显升高。与空白对照组相比有较显著的差异(P<0.01)。由于SOD活力降低，动物体内自由基含量增多，已知自由基对蛋白质、核酸、酶类有直接损伤作用，从而引起细胞内损伤，因此自由基可以损伤骨细胞的蛋白质、核酸及酶类影响胶原的合成。同时自由基也可诱发脂质还氧化物酶链反应，产生脂氢化氧化物酶，损伤骨细胞膜线粒体，溶酶体和微体，而使骨细胞死亡，在微循环中，自由基使血管内皮胶原和基膜中的透明质酸产生不可逆性降解。这种作用的结果是激活细胞趋化性，使血小板和颗粒细胞聚集，做为炎症反应的一部分，聚集的颗粒细胞又可释放出更多的自由基，更加损伤血管内皮细胞，使血管壁的通透性增加，导致组织水肿、缺血、缺氧〔9〕。从本试验的结果得出自由基代谢失常，是导致激素性股骨头缺血性坏死的可能原因之一。
4 参考文献
1 莫简，吕问，孙淑芳。医用自由基生物学导论。北京：人民卫生出版社，1989；93～160
, 百拇医药
2 Delmasetro RF.Rudiculs as medintors of tissue ingurg .Acta physiol Seand 1980；492：543
3 贺西京，毛履真，王坤正，等。肾上腺糖皮质激素引起股骨头缺血坏死的机制实验研究。中华骨科杂志 1992；12(6)：442
4 丁克祥，钟水先，姚树人。微量脂血超氧化物歧化酶快速测定法的研究。老年医学 1987；7(2)：42
5 魏明竟，血浆过氧化脂质的测定及其临床意义。国外医学·临床生物化学与检验学分册 1984；5(1)：6
6 邵洪。自由基与蛋白质代谢。国外医学·分子生物学分册 1990；12：42
7 张德治。自由基在大骨节病病理过程中的作用。北京医科大学学报1990；22：59
8 朱杰，魏西秦，张健，氧自由基对人胚胎软骨细胞DNA及基质成分合成的抑制作用。中华外科杂志 31(9)：561～563
9 Rusell RC。再灌注损伤和氧自由基。国外医学·创伤与外科基本问题 1989；10(4)：209
(1998-11-22收稿 1999-03-02修回)
《中医正骨》, 百拇医药