反义Survivin诱导食管鳞癌细胞凋亡
赵晶, 哈尔滨医科大学附属第二临床医学院消化内科 黑龙江省哈尔滨市 150086
刘铁夫, 博挽澜,哈尔滨医科大学附属第一临床医学院消化内科 黑龙江省哈尔滨市 150001
董春燕,中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科 上海市 200433
通讯作者:赵晶, 150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路246号, 哈尔滨医科大学附属第二临床医学院消化内科. qiaoxiao0451@126.com
电话: 0451-86605143
, http://www.100md.com
收稿日期: 2005-03-12 接受日期: 2005-04-01
摘要目的:研究Survivin ASODN联合三氧化二砷(As2O3)对食管鳞癌细胞系EC109凋亡的影响.
方法:设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸(ASODN).细胞分成6组:空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、160、200、240 nmol/L 反义链转染组.以阳离子脂质体为载体转染至EC109细胞内，用Western blot法检测各组细胞Survivin蛋白表达情况;TUNEL法检测细胞凋亡情况;MTT法检测As2O3和5-氟尿嘧啶(5-Fu)对转染前后细胞的生长抑制情况.
, 百拇医药 结果:各浓度ASODN 转染组癌细胞Survivin蛋白表达有不同程度减少，而各对照组细胞Survivin蛋白表达无明显变化.各ASODN 转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(5.48±1.56，6.04±1.95，11.92±1.76 vs 1.52±0.73，P<0.05)，以240 nmol/L转染组明显高于160和200 nmol/L组(11.92±1.76% vs 5.48±1.56%，6.04±1.95%，P<0.05).240nmol/L转染组中As2O3对肿瘤细胞生长抑制率明显高于5-Fu组(56.40±1.27% vs 43.49±0.83%，P<0.05).
结论:Survivin ASODN转染食管鳞癌细胞能下调Survivin蛋白的表达，诱导食管鳞癌细胞凋亡，抑制细胞增值，增加食管鳞癌细胞对化疗药物As2O3的敏感性.
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赵晶, 刘铁夫, 董春燕, 博挽澜. 反义Survivin诱导食管鳞癌细胞凋亡. 世界华人消化杂志 2005;13(12):1447-14491 (PDF) Western blot法检测转染后各组细胞Survivin蛋白表达情况. a: 空白对照组; b: 空脂质体转染对照组; c: 正义链转染对照组; d: 160 nmol/L ASODN组; e: 200 nmol/L ASODN组; f: 240 nmol/L ASODN组.
2.2 TUNEL法检测转染后各组细胞凋亡情况 各浓度ASODN转染可不同程度诱导EC109细胞凋亡，各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05)，以240 nmol/L ASODN组最为明显(P<0.05)，而各对照组间比较差异无显著性(P>0.05)(表1).
2.3 ASODN转染后食管鳞癌细胞对化疗药物敏感性变化情况 各组化疗药物对各浓度组ASODN转染的EC109细胞生长抑制率明显高于各对照组(P<0.05)(表1).
, 百拇医药
表1 转染后各组细胞的凋亡情况及生长抑制率
, http://www.100md.com
aP<0.05vs三组对照组，cP<0.05vs 160, 200 nmol/L ASODN转染组.eP<0.05vs三组对照组，gP<0.05vs 160, 200 nmol/L ASODN转染组.iP<0.05vs 三组对着组，kP<0.05vs 160, 200 nmol/L ASODN转染组，lP<0.05vs 240 nmol/L ASODN 5-Fu组.
3 讨论细胞凋亡是生物机体清除受伤细胞或无用细胞的一种生理机制，是在进化上非常保守的细胞死亡程序，而执行细胞凋亡的核心物质是一组半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，又称胱冬肽酶.机体在行使凋亡抑制作用时，凋亡抑制蛋白发挥着极为重要的作用，他主要包括Bcl-2家族中抗凋亡成员，死亡受体阻断分子和凋亡抑制蛋白(IAP)家族.Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosis proteins，IAP)家族的新成员，正常人主要见于胚胎和发育的胎儿组织，但不见于终末分化的成人组织(胸腺和生殖腺除外)，当细胞发生转化或者细胞恶变时又重新获得表达，在大多数肿瘤组织内均可检测到Survivin有不同程度的表达[5-6].Survivin与细胞周期调控和细胞凋亡的关系已经被大多数实验所证实[7-10].
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目前国内外就反义核酸Survivin诱导肿瘤细胞凋亡的研究正在逐渐展开，主要集中在白血病、胃癌[11]、肝癌[12]和胰腺癌[13]上，而对食管鳞癌的研究尚未见报道.As2O3用于肿瘤治疗的研究是近几年开展起来的，在治疗血液系统肿瘤中取得了良好的疗效.目前认为，其可能的作用机制是通过线粒体依赖途径诱导肿瘤细胞凋亡[14].在实体瘤治疗方面的研究显示其对肺腺癌GLC-82，胃腺癌MGC-803和SGC-7901、肝癌HepG-2，BEL-7402等肿瘤细胞系比较敏感，而对食管鳞癌EC109敏感性稍差[15]，限制了As2O3在食管鳞癌治疗方面的应用.
我们将不同浓度的SurvivinASODN转染至食管鳞癌EC109细胞内，观察转染后癌细胞的Survivin基因表达，癌细胞凋亡情况和癌细胞对化疗药物As2O3的敏感性变化.WesternBlot法结果显示各浓度ASODN转染组Survivin蛋白表达有不同程度的下调，以240nmol/L转染组最明显，说明SurvivinASODN封闭了Survivin基因，抑制了Survivin基因的表达.用TUNEL法检测转染后癌细胞的凋亡指数，结果显示各浓度ASODN转染组癌细胞凋亡指数均增高，和对照组比较有显著性差异，并与ASODN浓度成正相关.由此可见，封闭Survivin基因，可减少Survivin蛋白的表达，解除Survivin对凋亡的抑制作用，从而在一定程度上恢复癌细胞的凋亡机制，使癌细胞凋亡增多，抑制了肿瘤的发展.
, 百拇医药
食管鳞癌细胞对As2O3不敏感，限制他在食管鳞癌治疗方面的应用.本实验用SurvivinASODN转染食管鳞癌细胞后，使癌细胞的凋亡机制在一定程度上有所恢复，再给予化疗药物As2O3，结果显示转染后食管鳞癌细胞对As2O3的敏感性增高，与5-Fu组对比，对肿瘤细胞的生长具有更显著的抑制作用，这提示我们封闭Survivin基因表达和As2O3在诱导癌细胞凋亡方面具有协同作用，但SurvivinASODN和As2O3在诱导肿瘤细胞凋亡方面的协同作用机制还有待于进一步的研究.
总之，本实验的研究结果显示以Survivin作为靶位的基因治疗具有可行性，并为As2O3在食管鳞癌治疗方面的应用奠定了一定的实验基础.
, 百拇医药
4 参考文献1 Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novelantiapoptosis gene, survivin, expression in cancer and lymphoma.
Nature Med 1997;3:917-921
2 高虎, 赵治华, 杨峰.三氧化二砷诱导细胞凋亡治疗消化道肿瘤的研究.世界华人消化杂志 2002;10:710-711
3 Xia C, Xu Z, Yuan X, Uematsu K, You L, Li K, Li L, McCormick F,Jablons DM. Induction of apoptosis in mesothelioma
, 百拇医药 cells by antisurvivinoligonucleotides. Mol Cancer Ther 2002;1:687-694
4 韩锐. 抗癌药物研究与实验技术.第一版.北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1997:447-448
5 Adida C, Crotty PL, McGrath J, Berrebi D, Diebold J, Altieri DC.Developmentally regulated expression of the novel
cancer anti-apoptosis gene survivinin human and mouse differentiation. Am J Pathol 1998;152:43-19
6 Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S, Marchisio PC,Altieri DC. Control of apoptosis and mitotic spindle
, 百拇医药
checkpoint by survivin. Nature 1998;396:580-584
7 Suzuki A, Hayashida M, Ito T, Kawano H, Nakano T, Miura M, AkahaneK, Shiraki K. Survivin initiates cell cycle entry by
the competitive interaction withCdk4/p16 (INK4a) and Cdk2/cyclin E complex activation. Oncogene 2000;19:3225-3234
8 Tamm I, Wang Y, Sausville E, Scudiero DA, Vigna N, Oltersdorf T,Reed JC. IAP-family protein survivin inhibits caspase
, 百拇医药
activity and apoptosis induced byFas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs. Cancer Res 1998;58:5315-5320
9 Ito T, Shiraki K, Sugimoto K, Yamanaka T, Fujikawa K, Ito M, TakaseK, Moriyama M, Kawano H, Hayashida M, Nakano T,Suzuki A. Survivin promotes cellproliferation in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 2000;31:1080-1085
10 Shin S, Sung BJ, Cho YS, Kim HJ, Ha NC, Hwang JI, Chung CW, Jung YK,Oh BH. An anti-apoptotic protein human
, 百拇医药
survivin is a direct inhibitorof caspase-3 and-7. Biochemistry 2001;40:1117-1123
11 Yang JH, Zhang YC, Qian HQ. Survivin antisense oligodeoxynucleotideinhibits growth of gastric cancer cells.
World J Gastroenterol 2004;10:1121-1124
12 Cheng SQ, Wang WL, Yan W, Li QL, Wang L, Wang WY. Knockdown ofsurvivin gene expression by RNAi induces
apoptosis in humanhepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721. World J Gastroenterol 2005;11:756-759
, http://www.100md.com
13 王亚利, 宋天保, 王西京,王中卫, 宋潍,郝小静.Survivin mRNA反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡.
世界华人消化杂志 2004;12:1872-1874
14 Shen ZY, Shen WY, Chen MH, Shen J, Cai WJ, Yi Z. Nitric oxide andcalcium ions in apoptotic esophageal
carcinoma cells induced by arsenite. World J Gastroenterol 2002;8:40-43
15 林晨, 邓友平, 郑杰,付明, 陈洁平, 肖培根,吴旻. 三氧化二砷诱导人肿瘤细胞凋亡和G2+M期阻滞但引起人
永生化宫颈上皮细胞G1 期阻滞. 中国医学科学院学报 2000;22:124-129
编辑 张海宁, 百拇医药( 赵 晶, 刘铁夫, 董春燕,博挽澜)
刘铁夫, 博挽澜,哈尔滨医科大学附属第一临床医学院消化内科 黑龙江省哈尔滨市 150001
董春燕,中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科 上海市 200433
通讯作者:赵晶, 150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路246号, 哈尔滨医科大学附属第二临床医学院消化内科. qiaoxiao0451@126.com
电话: 0451-86605143
, http://www.100md.com
收稿日期: 2005-03-12 接受日期: 2005-04-01
摘要目的:研究Survivin ASODN联合三氧化二砷(As2O3)对食管鳞癌细胞系EC109凋亡的影响.
方法:设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸(ASODN).细胞分成6组:空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、160、200、240 nmol/L 反义链转染组.以阳离子脂质体为载体转染至EC109细胞内，用Western blot法检测各组细胞Survivin蛋白表达情况;TUNEL法检测细胞凋亡情况;MTT法检测As2O3和5-氟尿嘧啶(5-Fu)对转染前后细胞的生长抑制情况.
, 百拇医药 结果:各浓度ASODN 转染组癌细胞Survivin蛋白表达有不同程度减少，而各对照组细胞Survivin蛋白表达无明显变化.各ASODN 转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(5.48±1.56，6.04±1.95，11.92±1.76 vs 1.52±0.73，P<0.05)，以240 nmol/L转染组明显高于160和200 nmol/L组(11.92±1.76% vs 5.48±1.56%，6.04±1.95%，P<0.05).240nmol/L转染组中As2O3对肿瘤细胞生长抑制率明显高于5-Fu组(56.40±1.27% vs 43.49±0.83%，P<0.05).
结论:Survivin ASODN转染食管鳞癌细胞能下调Survivin蛋白的表达，诱导食管鳞癌细胞凋亡，抑制细胞增值，增加食管鳞癌细胞对化疗药物As2O3的敏感性.
, http://www.100md.com
赵晶, 刘铁夫, 董春燕, 博挽澜. 反义Survivin诱导食管鳞癌细胞凋亡. 世界华人消化杂志 2005;13(12):1447-14491 (PDF) Western blot法检测转染后各组细胞Survivin蛋白表达情况. a: 空白对照组; b: 空脂质体转染对照组; c: 正义链转染对照组; d: 160 nmol/L ASODN组; e: 200 nmol/L ASODN组; f: 240 nmol/L ASODN组.
2.2 TUNEL法检测转染后各组细胞凋亡情况 各浓度ASODN转染可不同程度诱导EC109细胞凋亡，各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05)，以240 nmol/L ASODN组最为明显(P<0.05)，而各对照组间比较差异无显著性(P>0.05)(表1).
2.3 ASODN转染后食管鳞癌细胞对化疗药物敏感性变化情况 各组化疗药物对各浓度组ASODN转染的EC109细胞生长抑制率明显高于各对照组(P<0.05)(表1).
, 百拇医药
表1 转染后各组细胞的凋亡情况及生长抑制率
| 细胞分组 | AI(%) | IR(%) | |
| 5-Fu | As2O3 | ||
| 空白对照组 | 1.52±0.73 | 25.44±3.39 | 36.51±5.45 |
| 空脂质体转染 | |||
| 对照组 | 1.84±0.89 | 24.48±2.55 | 33.35±2.04 |
| 正义链转染 | |||
| 对照组 | 2.16±0.74 | 25.01±3.11 | 35.46±0.67 |
| 160nmol/L | |||
| ASODN转染组 | 5.48±1.56a | 33.14±1.98e | 43.92±1.23i |
| 200nmol/L | |||
| ASODN转染组 | 6.04±1.95a | 36.42±1.32e | 46.37±0.50i |
| 240nmol/L | |||
| ASODN转染组 | 11.92±1.76ac | 43.49±0.83eg | 56.40±1.27ikl |
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aP<0.05vs三组对照组，cP<0.05vs 160, 200 nmol/L ASODN转染组.eP<0.05vs三组对照组，gP<0.05vs 160, 200 nmol/L ASODN转染组.iP<0.05vs 三组对着组，kP<0.05vs 160, 200 nmol/L ASODN转染组，lP<0.05vs 240 nmol/L ASODN 5-Fu组.
3 讨论细胞凋亡是生物机体清除受伤细胞或无用细胞的一种生理机制，是在进化上非常保守的细胞死亡程序，而执行细胞凋亡的核心物质是一组半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，又称胱冬肽酶.机体在行使凋亡抑制作用时，凋亡抑制蛋白发挥着极为重要的作用，他主要包括Bcl-2家族中抗凋亡成员，死亡受体阻断分子和凋亡抑制蛋白(IAP)家族.Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosis proteins，IAP)家族的新成员，正常人主要见于胚胎和发育的胎儿组织，但不见于终末分化的成人组织(胸腺和生殖腺除外)，当细胞发生转化或者细胞恶变时又重新获得表达，在大多数肿瘤组织内均可检测到Survivin有不同程度的表达[5-6].Survivin与细胞周期调控和细胞凋亡的关系已经被大多数实验所证实[7-10].
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目前国内外就反义核酸Survivin诱导肿瘤细胞凋亡的研究正在逐渐展开，主要集中在白血病、胃癌[11]、肝癌[12]和胰腺癌[13]上，而对食管鳞癌的研究尚未见报道.As2O3用于肿瘤治疗的研究是近几年开展起来的，在治疗血液系统肿瘤中取得了良好的疗效.目前认为，其可能的作用机制是通过线粒体依赖途径诱导肿瘤细胞凋亡[14].在实体瘤治疗方面的研究显示其对肺腺癌GLC-82，胃腺癌MGC-803和SGC-7901、肝癌HepG-2，BEL-7402等肿瘤细胞系比较敏感，而对食管鳞癌EC109敏感性稍差[15]，限制了As2O3在食管鳞癌治疗方面的应用.
我们将不同浓度的SurvivinASODN转染至食管鳞癌EC109细胞内，观察转染后癌细胞的Survivin基因表达，癌细胞凋亡情况和癌细胞对化疗药物As2O3的敏感性变化.WesternBlot法结果显示各浓度ASODN转染组Survivin蛋白表达有不同程度的下调，以240nmol/L转染组最明显，说明SurvivinASODN封闭了Survivin基因，抑制了Survivin基因的表达.用TUNEL法检测转染后癌细胞的凋亡指数，结果显示各浓度ASODN转染组癌细胞凋亡指数均增高，和对照组比较有显著性差异，并与ASODN浓度成正相关.由此可见，封闭Survivin基因，可减少Survivin蛋白的表达，解除Survivin对凋亡的抑制作用，从而在一定程度上恢复癌细胞的凋亡机制，使癌细胞凋亡增多，抑制了肿瘤的发展.
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食管鳞癌细胞对As2O3不敏感，限制他在食管鳞癌治疗方面的应用.本实验用SurvivinASODN转染食管鳞癌细胞后，使癌细胞的凋亡机制在一定程度上有所恢复，再给予化疗药物As2O3，结果显示转染后食管鳞癌细胞对As2O3的敏感性增高，与5-Fu组对比，对肿瘤细胞的生长具有更显著的抑制作用，这提示我们封闭Survivin基因表达和As2O3在诱导癌细胞凋亡方面具有协同作用，但SurvivinASODN和As2O3在诱导肿瘤细胞凋亡方面的协同作用机制还有待于进一步的研究.
总之，本实验的研究结果显示以Survivin作为靶位的基因治疗具有可行性，并为As2O3在食管鳞癌治疗方面的应用奠定了一定的实验基础.
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4 参考文献1 Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novelantiapoptosis gene, survivin, expression in cancer and lymphoma.
Nature Med 1997;3:917-921
2 高虎, 赵治华, 杨峰.三氧化二砷诱导细胞凋亡治疗消化道肿瘤的研究.世界华人消化杂志 2002;10:710-711
3 Xia C, Xu Z, Yuan X, Uematsu K, You L, Li K, Li L, McCormick F,Jablons DM. Induction of apoptosis in mesothelioma
, 百拇医药 cells by antisurvivinoligonucleotides. Mol Cancer Ther 2002;1:687-694
4 韩锐. 抗癌药物研究与实验技术.第一版.北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1997:447-448
5 Adida C, Crotty PL, McGrath J, Berrebi D, Diebold J, Altieri DC.Developmentally regulated expression of the novel
cancer anti-apoptosis gene survivinin human and mouse differentiation. Am J Pathol 1998;152:43-19
6 Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S, Marchisio PC,Altieri DC. Control of apoptosis and mitotic spindle
, 百拇医药
checkpoint by survivin. Nature 1998;396:580-584
7 Suzuki A, Hayashida M, Ito T, Kawano H, Nakano T, Miura M, AkahaneK, Shiraki K. Survivin initiates cell cycle entry by
the competitive interaction withCdk4/p16 (INK4a) and Cdk2/cyclin E complex activation. Oncogene 2000;19:3225-3234
8 Tamm I, Wang Y, Sausville E, Scudiero DA, Vigna N, Oltersdorf T,Reed JC. IAP-family protein survivin inhibits caspase
, 百拇医药
activity and apoptosis induced byFas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs. Cancer Res 1998;58:5315-5320
9 Ito T, Shiraki K, Sugimoto K, Yamanaka T, Fujikawa K, Ito M, TakaseK, Moriyama M, Kawano H, Hayashida M, Nakano T,Suzuki A. Survivin promotes cellproliferation in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 2000;31:1080-1085
10 Shin S, Sung BJ, Cho YS, Kim HJ, Ha NC, Hwang JI, Chung CW, Jung YK,Oh BH. An anti-apoptotic protein human
, 百拇医药
survivin is a direct inhibitorof caspase-3 and-7. Biochemistry 2001;40:1117-1123
11 Yang JH, Zhang YC, Qian HQ. Survivin antisense oligodeoxynucleotideinhibits growth of gastric cancer cells.
World J Gastroenterol 2004;10:1121-1124
12 Cheng SQ, Wang WL, Yan W, Li QL, Wang L, Wang WY. Knockdown ofsurvivin gene expression by RNAi induces
apoptosis in humanhepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721. World J Gastroenterol 2005;11:756-759
, http://www.100md.com
13 王亚利, 宋天保, 王西京,王中卫, 宋潍,郝小静.Survivin mRNA反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡.
世界华人消化杂志 2004;12:1872-1874
14 Shen ZY, Shen WY, Chen MH, Shen J, Cai WJ, Yi Z. Nitric oxide andcalcium ions in apoptotic esophageal
carcinoma cells induced by arsenite. World J Gastroenterol 2002;8:40-43
15 林晨, 邓友平, 郑杰,付明, 陈洁平, 肖培根,吴旻. 三氧化二砷诱导人肿瘤细胞凋亡和G2+M期阻滞但引起人
永生化宫颈上皮细胞G1 期阻滞. 中国医学科学院学报 2000;22:124-129
编辑 张海宁, 百拇医药( 赵 晶, 刘铁夫, 董春燕,博挽澜)
