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关键词：一氧化氮合酶；超氧化物歧化酶；基因表达；自发性高血压大鼠
摘 要：目的 探讨自发性高血压大鼠(SHR)中枢一氧化氮(NO)、超氧阴离子改变及可能作用。方法 采用酶法及RT-PCR等测定SHR脑皮质超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性及两种亚型(cNOS、iNOS)表达。结果 与对照组比较SHR脑皮质SOD活性显著增高(P<0.05)，NOS活性无差异(P>0.05)，iNOS表达降低(P<0.01)，cNOS表达增高(P<0.05)。结论 NOS各亚型改变不同，提示其生物学效应各异，在SHR发病中意义亦不同,而NOS活性不能反映局部亚型变化，局部超氧阴离子可能参与NO代谢。故调控NOS不同亚型及抗氧化治疗，可能有助于抗高血压、预防脑并发症。
分类号 ：R743.2 文献标识码 ：A
文章编号 ：1003-2754(2000)01-0020-02
Subtype NOS geneexpression of NOS and SOD activity in spontaneously hypertensive rat brain
CHU Shao-li MA Yan-hong ZHAO Guang-sheng.
(Shanghai Institute of Hypertension,Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second MedicalUniversity,Shanghai 200025,China)
Abstract ： Objective To investigate the possible roleof central NO and superoxide anion alteration in spontaneously hypertensive rat (SHR).Method The expression of two nitricoxide synthase subtypes and the activity of superoxide dismutase were measured by RT-PCRin cerebral cortex of 20-week-old SHR male rat. Results No markly difference of NOSactivity was showed between SHR cerebral cortex and control group. NOS expresseddown-regulation(P<0.01). NOS expressed up-regulation(P<0.05). At mean time SODactivity was enhanced. The different alteration of NOS subtype in SHR cerebral cortexdemonstrated their different biological effects and their different significances in theetiology of SHR. However the activity of NOS can not reflect the alteration of local NOSsubtype and superoxide anion involves in NO metabolism. Conclusion The regulation of different NOSsubtypes and anti-oxide therapy may be beneficial to antihypertension and cerebralcomplication prevention.
Keywords ： Nitric oxide synthase; Super oxide dismutase; Gene expression; Spontaneously hypertensive rat ▲
高血压是脑卒中危险因素之一。一氧化氮(NO)为细胞信使分子和新型神经递质，参与血管张力、血小板粘附与聚集、神经系统功能、脑组织损害-抗损害等过程的调节。探讨高血压时中枢NO与相关系统氧自由基间的相互关系，对阐明高血压病(HT)、高血压性脑卒中发病机制有重要意义，为有效地控制HT及其脑并发症、改善其预后提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 20周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)、Wistar京都大鼠(WKY)由上海市高血压研究所提供。每组各8只，体重310～350g,SHR与WKY动脉收缩压分别为27.64±1.55kPa、17.87±0.83kPa。
1.2 引物合成 根据文献[1～3] 由中国科学院上海植物生理研究所DNA合成仪合成。原生型一氧化氮合酶(cNOS,599bp)：上游5’-GCCGGATCCTCCAGGAGGGTGTCCACCGCATG-3’;下游5’-CCGGAATTCGAATACCAGCCTGATCCATGGA
A-3’。 诱导型一氧化氮合酶(iNOS,576bp) ： 上游5’-GTGTTCCACCAGGAGATGTTG-3’; 下游5’-CTCCTGCCCACTGAGTTCGTC-3’ 。 β-actin(540bp)：上游5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-
A-3’;下游5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATT-
TC-3’。
1.3 指标测定 实验动物断头取大脑皮质，冰生理盐水洗涤，液氮冷冻后置-70℃待测。
1.3.1 NOS活性测定 参照文献[4] 采用3 H-精氨酸转换为3 H-胍氨酸的液闪法测定。活性以每分钟每克蛋白生成3 H-胍氨酸pmol数表示。
1.3.2 iNOS、cNOS、β-actin mRNA测定 采用RT-PCR法，即用一步法抽提总RNA,参照文献[3] 进行3种特异引物的RT-PCR扩增，其条件：(1)cNOS：94℃1min，68℃ 1min， 72℃ 2.5min， 首次循环94℃ 3min, 共35个循环； (2)iNOS：94℃1min, 62℃ 1min, 72℃ 2.5min,首次循环94℃ 3min,共35个循环；(3)β-actin：94℃45s,60℃ 1min,72℃ 45s,首次循环94℃ 3min,共30个循环。每种PCR结束前72℃20min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭染色、摄片、光密度扫描，以相应β-actin光密度(OD)进行标准校正。
1.3.3 SOD活性测定 采用黄嘌呤氧化酶法(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)测定SOD活性，其活力以每毫升反应液中SOD抑制率为50%时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位(NU/ml)，再换算成NU/mg蛋白。
1.3.4 蛋白浓度测定 采用考马斯亮兰染料法[5] 。
1.4 统计学处理 数据以±s表示，组间比较采用配对t检验，显著性标准P<0.05。
2 结 果
SHR与WKY比较，大脑皮质NOS活性无改变(P>0.05),iNOS表达降低(P<0.01),cNOS表达增高(P<0.05);而SOD活性亦增高(P<0.05)(见表1)。
表1 SHR和WKY两组大鼠大脑皮质NOS活性、NOS亚型基因表达、SOD活性比较
| 项目 | 只数 | SHR | WKY | P值 |
| NOS活性[pmol/(g. min)] iNOS mRNA (iNOS OD/β-actin OD) cNOS mRNA (cNOS OD/β-actin OD) SOD活性(NU/mg pro) | 8 5 5 8 | 24.30±10.24 0.173±0.064 0.750±0.085 52.37±6.97 | 26.39±6.90 0.573±0.149 0.585±0.062 40.93±8.66 | >0.05 <0.01 <0.05 <0.05 |
3 讨 论
NO具有广泛的生物学功能，因此，在HT、动脉粥样硬化及脑卒中的作用倍受关注。然而迄今为止，对SHR组织NOS改变及其作用研究结果不一，争论很大。NOS是体内合成NO的关键酶。根据其是否依赖钙及钙调素而分为cNOS和iNOS，两种亚型是不同基因编码的产物。已有研究[6] 表明HT时氧自由基增加可促进血压升高，但中枢NOS亚型与超氧阴离子间的关系及在HT时的作用报道极少，本研究旨在探讨高血压时中枢NO与氧自由基间相互关系，阐明其在HT、高血压性脑卒中发病中的可能作用，为有效地控制HT及其脑并发症提供实验依据。
检测组织NOS活性的局限性，结果表明SHR大脑皮质NOS活性无明显改变，但不同亚型NOS表达却改变不同，这提示在研究组织NO水平时，检测NOS活性有一定的局限性，除自身检测受多因素影响外，其更大的缺陷是不能反映不同病理、生理条件下NOS不同亚型的改变及局部环境对NO的影响。
NOS不同亚型在不同的疾病、不同的病理阶段，起着不同的作用。本研究发现，SHR大脑皮质cNOS基因表达明显增高，而iNOS降低。提示两种亚型可能具有不同的生物学特点，已经证明iNOS经诱导后呈长时、暴发性释放NO，这一特性使其在应激状态下能迅速作出反应，从而缓解应激时的不利效应。如有报道高盐负荷时，肾组织iNOS表达增加，其盐敏感高血压大鼠NOS缺陷是导致盐负荷时血压升高的原因之一[7] 。因此，在应激状态下(如卒中)iNOS的作用强于cNOS，而在长期高血压时可能后者起主要调节作用。
有报道氧自由基参与HT发病机制，其主要是促使NO失活。本研究发现SHR大脑皮质SOD活性和cNOS基因表达均明显增高，可能原因为高血压时超氧阴离子增加，内皮细胞通过增加SOD活性以清除过量超氧阴离子，后者大量产生，促使NO失活，经过负反馈调节促进cNOS的转录；同时，在病理状态下NO和超氧阴离子可形成高毒性的过氧亚硝酸盐,导致或加重组织损害。
高血压时中枢神经系统NO及NOS变化复杂，局部NOS活性不能反映不同亚型改变，具有很大局限性；NOS不同亚型具有不同生物学特点，iNOS可能是应激状态下的主要作用因子，长期慢性病变时cNOS起主要作用；而且，中枢系统NO可能具有损害-抗损害双重作用。其氧自由基可能参与中枢的血压调节。因此，NOS不同亚型的调控及抗氧化治疗，可能对有效抗高血压、预防脑卒中的发生、防止脑组织损伤具有重要意义。
参考文献：
[1]Sessa WC,Harrison JK,Barber CM,et al.Molecular cloning and expression of a cDNA encoding endothelial cell nitricoxide synthase[J].J Bio Chem,1992,26(22)：15274-15276.
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[3]赵涵芳，程 枫，章有章.用RT-PCR方法检测烧伤愈合时生长因子的表达[J].上海第二医科大学学报，1995，15(Suppl)：37-42.
[4]张新波，黄海鹭，张灵芝，等.一氧化氮合成酶(NOS)活性的测定及其应用[J].北京医科大学学报，1994，26(增刊)：173-176.
[5]Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantitiesof protein utilizing the principle of protein-dyebinding[J]. Anal Biochem,1976,72(1)：248-254.
[6]Andreas ML,James HE,Tlmothy EP,et al. Release of intact endothelium derivedrelaxing factor depends on endothelial superoxide dismutase activity[J]. Am JPhysiol,1991,260：219-225.
[7]Anna FD,David FB. Nitric oxide and its putative role in hypertension[J].Hypertension，1995,25(6)：1202-1211.
收稿日期：1998-03-23
修改日期：1999-09-15 , http://www.100md.com