关键词：拟血管性痴呆；小鼠；皮层；海马；病理形态学；迟发性坏死
摘 要： 目的 观察脑缺血再灌注拟血管性痴呆小鼠大脑皮层及海马细胞病理形态学的较长期演变。方法 复制脑缺血再灌注拟血管性痴呆小鼠模型，分别于术后7d、15d、30d脑部取材，石蜡切片，HE与Nissl染色，对皮层及海马细胞病理形态学进行较长期动态观察。结果 7d模型小鼠大脑皮质变薄，部分神经细胞核固缩，局限性神经元数目减少，出现筛网状结构，胶质细胞增生，15d、30d镜下与7d基本相同。海马CA1 区细胞脱失，随时间推移逐渐加重，至术后30d，海马CA1 区细胞几乎完全脱失，胶质细胞大量增生，形成结节，CA2 、CA3 区细胞也严重脱失，呈现海马硬化。结论 海马锥体细胞的迟发性坏死是缺血性脑血管病致痴呆的病理学基础。
中图分类号：R743 文献标识码：A 文章编号：1003-2754(2000)04-0200-03
Pathomorphology dynamic observation on cortex and hippocampal cell of cerebral ischemia reperfusion synthetic vascular dementia model mouse
ZHAO Jian-xin TIANYuan-xiang LIGuo-ming,et al.
( T.C.M.College,HeBeiMedical University,Shijiazhuang 050091,China )
Abstract: Objective To observe comparativelylong-period changes of cerebral cortex and hippocampal cell pathomorphology of cerebralischemia reperfusion synthetic vascular dementia model mouse. Method To duplicate cerebral ischemia reperfusion syntheticvascular dementia model mouse,extract materials from brain at the seventh day,fifteenthday and thirtieth day respetively after the operation,and then make paraffin section andHE and Nissl staining as well as make long-period observation on cortex and hippocampalcell pathomorphology. Result The cerebral cortex of model mouse became thinner on the seventh day,partialnervous karyopyknosis was formed,the number of local neuron was reduced;sieve structurewas formed,and glial cells were proliferated,with basically the same result on seventhday,fifteenth day and thirtieth day. Model mouse ， s hippocampal cells in CA1 area were reducedand gradually became completely lost at the thirtieth day after operation. At the sametime,glial cells were abundantly proliferated,tubercles were formed,cells in CA2 、 CA3 area were alsoreduced and so caused hippocampal sclerosis. Conclusion Delayed necrosis of hippocampal pyramidal cells should bethe pathological base of ischemic cerebral vascular dementia.
Key words: Syntheticvascular dementia; Mouse; Hippocampal; Pathomorphology; Delayed necrosis ▲
血管性痴呆(Vasculardementia，VD)是指各种脑血管病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征，为一慢性进行性疾病[1] ，主要与缺血性脑血管病有关，动物实验一般采用脑缺血再灌注模型模拟临床发病过程。主要有完全性脑缺血再灌流大鼠模型和不完全性脑缺血再灌流小鼠模型。目前对后者仅限于8d内的短期观察，缺乏较长期的深入研究。因此，作为课题研究的一部分，复制脑缺血再灌注拟血管性痴呆小鼠模型，行为学实验(跳台法)显示小鼠出现明显学习记忆障碍[2] ，并于术后7d、15d、30d对皮层及海马细胞病理形态学进行动态观察，报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 昆明小鼠36只，体重25～28g，由河北医科大学实验动物中心提供。
1.2 仪器 OLYMPUS VANOX PM-10AD型显微照相仪(日本)，连续变倍体视显微镜(XTS20型，北京)，LEICA切片机(RM2125型，德国)，恒温式附贴切片展片仪(ZHPY型，河北医科大学)，电热恒温培养箱(HHBII060型，天津)。
1.3 药物 硫堇(进口分装，批号：820910)，多聚甲醛(分析纯，天津市化学试剂研究所，批号：930606)，磷酸氢二钠(分析纯，天津市化学试剂六厂，批号850413)，磷酸二氢钠(分析纯，北京益利精细化学品有限公司，批号970726)。
1.4 模型制备 选取健康昆明小鼠，适应饲养1周。将小鼠随机分为正常组、假手术组、模型组，每组各12只。参考文献[3] ，将模型组用水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，消毒，颈正中切口，体视镜下分离双侧颈总动脉，大套“4”号丝线扣备用。拉紧丝扣，阻断血流20min，并同时在距尾尖1cm处剪断放血约0.3ml，热凝止血。松开丝扣灌注10min后，再次阻断血流20min，第2次再灌后观察30min。缝合皮肤，术后每日肌注青霉素0.2万单位，连续3d。假手术组只分离颈总动脉，套丝扣，但不阻断血流，尾部不放血，观察时间等与模型组相同。
1.5 皮层及海马细胞形态学观察 分别于术后7d、15d、30d，每组随机取4只，参考文献[4] 方法用水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，迅速剖开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，夹持心尖，自心尖左侧剪开左心室，将大隐静脉穿刺针经左心室插入升主动脉，灌注生理盐水，待血色变淡后，继以4%多聚甲醛灌注固定，直至动物呈僵硬状态。原位静置1h后取脑，用上述固定后固定。取视交叉至乳头体组织，常规石蜡包埋，冠状切片，厚度8μm，每隔2张取1张，HE、0.1%硫堇染色[5] ，光学显微镜下观察皮层及海马细胞形态变化。
2 结果
正常组与假手术组小鼠，手术后7d、15d、30d，均脑组织外观光洁，两侧大脑半球基本等大，组织无萎缩。皮层细胞形态、结构正常。海马锥体细胞2～3层，排列紧密(见图1)，细胞核圆而大，核仁清晰，硫堇染色示胞浆内尼氏体丰富，神经纤维密集，排列整齐。术后7d，模型组中一只右侧大脑半球较左侧小，表面呈黄白色瘢痕样，质硬，其余外观未见异常。镜下皮质变薄，部分神经细胞核固缩，局限性神经元数目减少，出现筛网状结构，胶质细胞增生。海马CA1 区锥体细胞层次减少，排列稀疏，胞浆内尼氏体消失，细胞核体积变小，深染，结构不清，呈核固缩表现，神经纤维排列紊乱，齿状回细胞亦有核固缩现象(见另文)。术后15d，模型组两只右侧，一只左侧大脑半球较对侧小，表面呈黄白色瘢痕样，质硬。镜下海马CA1 区锥体细胞排列进一步稀疏，细胞核固缩为三角形或多角形，脱失现象明显(见另文)。术后30d，模型组两只右侧，一只左侧大脑半球较对侧小，表面呈黄白色瘢痕样，质硬。镜下皮质表现基本同7d和15d。海马CA1 区细胞几乎完全脱失，CA2 、CA3 区细胞也严重脱失(见图2)，仅见少量残存的不规则细胞(见图3)，胶质细胞大量增生，形成结节，呈现海马硬化(见图4)。
图1 正常组 海马锥体细胞2～3层，排列紧密。HE×40
图2 术后30d模型组 海马CA1 区细胞几乎完全脱失，
CA2 、CA3 区细胞也严重脱失。Nissl×40
图3 术后30d在模型组 海马CA1 区细胞几乎完全脱失，
仅见少量残存的不规则细胞。Nissl×400
图4 术后30d模型组 海马锥体细胞脱失处胶质细
胞大量增生，形成胶质结节。HE×100
3 讨论
海马与学习记忆密切相关，是脑缺血选择性易损部位，海马各段对缺血易损伤性依次为：CA1 、门区>CA2 >CA3 >齿状回[6] 。目前对完全性脑缺血再灌流大鼠模型研究较多，观察时间从缺血后即时，再灌流数分钟至90d不等，其损伤部位和程度也不同。大鼠缺血5～30min，即有CA1 和门区损害，CA3 保留，齿状回正常。损伤的特点是选择性神经元坏死，星状细胞和血管细胞保留。CA1 神经元2～3d内在光镜水平可有形态学恢复，CA3 神经元的改变大多为可逆性的反应性变化。经再灌流90d后，细胞死亡丢失扩展到CA2 /CA3 区[7] 。
对小鼠模型的研究目前还主要限于8d内的研究。术后8d，额叶皮层锥体细胞核固缩，胶质细胞增生，形成多处结节，海马CA1 区细胞缺失、排列不规则，齿状回可见颗粒细胞空泡变性[8] 。对模型随着灌流时间延长，进一步的病理变化，尚未见文献报道。
本研究对脑缺血再灌注拟血管性痴呆小鼠模型分7d、15d、30d 3个时段进行了较长期的病理形态学动态观察，结果显示不同时段模型组小鼠皮层病变、海马细胞形态学改变与正常组和假手术组明显不同。正常组小鼠皮层细胞形态、结构正常，假手术组与正常组基本一致。7d模型组小鼠镜下大脑皮质变薄，部分神经细胞核固缩，局限性神经元数目减少，出现筛网状结构，已见胶质细胞增生修复。15d、30d镜下皮质病变与7d基本相同，但大脑半球大体形态出现异常改变的鼠的数目增多。正常组小鼠海马CA1 区锥体细胞呈复层排列，细胞核圆而大，核仁清晰，硫堇染色示胞浆内尼氏体丰富，神经纤维密集，排列整齐。假手术组与正常组基本相同。模型组于术后7d即已见海马CA1 区锥体细胞层次减少，排列稀疏，胞浆内尼氏体消失，细胞核体积变小，深染，结构不清，呈核固缩表现，神经纤维排列紊乱，齿状回细胞亦有核固缩现象。术后15d，海马CA1 区锥体细胞排列进一步稀疏，细胞核固缩为三角形或多角形，脱失现象明显。术后30d，海马CA1 区细胞几乎完全脱失，仅见少量残存的不规则细胞，CA2 、CA3 区细胞也严重脱失，胶质细胞大量增生，形成结节，呈现海马硬化，与再灌流90d大鼠模型[7] 的相关研究基本相符。
对该模型动物的行为学变化观察显示：模型组术后30d的学习记忆成绩较假手术组明显下降，即学习记忆障碍显著。有实验表明，海马及其周围皮层是外显记忆神经通路的重要组成成分，同时损伤海马和周围皮层，会出现严重的记忆障碍[9] 。本研究亦观察到该模型小鼠皮层及海马同时受损，且海马锥体细胞的迟发性坏死随灌流时间延长而逐渐加重，可见模型组的病理表现与行为学变化是一致的。提示海马锥体细胞的迟发性坏死是缺血性脑血管病致痴呆的病理学基础。本研究为临床长期治疗，提供了病理学参考。■
基金项目：河北省卫生厅资助项目(99012)
参考文献：
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收稿日期： 2000-02-28
修订日期： 2000-06-02 , 百拇医药