关键词：血管紧张素转换酶；糜酶；蛋白酶抑制剂；放射免疫法
摘要：为研究糜酶的功能，本文利用蛋白酶抑制剂Lisinopril、Aprotinin及EDTA结合放射免疫分析的方法同时测定了糜酶转基因小鼠心脏组织中血管紧张素转换酶(angiotensinconverting enzyme，ACE)及糜酶样活性。结果显示转基因小鼠心脏组织中糜酶比活力(0.274±0.071U/mg蛋白)较对照(0.152±0.021U/mg蛋白)显著升高，而ACE比活力不变(分别为0.172±0.029U/mg蛋白和0.177±0.019U/mg蛋白)。同时测定出转基因小鼠心脏局部血管紧张素II(angiotensinII，Ang II)含量(1984±184pg/g心脏组织)为对照(568±88pg/g心脏组织)的3倍。表明糜酶转基因小鼠心脏中可表达糜酶且糜酶能催化AngII 的生成，而蛋白酶抑制剂结合放免分析是一种快速、灵敏的检测ACE及糜酶样活性的方法。
中图分类号：Q556.3 文献标识码：A 文章编号：1001-6325(2000)03-0090-03
Activities of angiotensin converting enzyme and chymase-like in the heart of
chymase transgenic mice
WANG Xing，LI Peng，CHENLan-ying
(Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，CardiovascularInstitute&Fu Wai Hospital，Beijing100037，China)
Abstract: To study the function ofchymase，the protease inhibitors including Lisinopril，Aprotinin and EDTA，andradioimmunuoassy were used to measure the activities of angiotensin converting enzyme(ACE) and chymase in the heart tissues of transgenic mice harboring the human heartchymase gene and the controls.Compared to the control，it was showed that the chymase-like activity increased remarkably (0.274±0.071U/mg protein vs 0.152±0.021U/mgprotein) but the activity of ACE unchanged (0.172±0.029U/mg protein vs 0.177±0.019U/mgprotein).The level of angiotensin(Ang) in the transgenic mice (1984±184pg/g hearttissue) were also measured as much as three times than that in control (568±88pg/g hearttissue) by radioimmunuoassy.The results suggested that the chymase could convert Ang Ito Angin vivo，and the radioimmunoassay method could detect the activities of ACE andchymase simultaneously with high sensitivity and credibility.
Key words: angiotensin converting enzyme; chymase; protease inhibitor;radioimmunoassay
血管紧张素(angiotensin，Ang)是心血管系统中的一个重要的生物活性肽，除参与血压调节外，还能直接对心肌细胞的收缩力、节律和肥大产生影响。由血管紧张素转换酶(angiotensinconverting enzyme，ACE)催化的血管紧张素I(angiotensin I，AngI)转化为Ang长期以来被认为是Ang的主要生成途径，九十年代后体外实验发现在人心脏中还存在着另外一种Ang生成酶，即糜酶，也能将AngI转化为Ang，并推测糜酶的作用可能是心脏局部Ang的主要来源[1]。因此测量心脏组织中ACE及糜酶的相对活力是研究其在心脏中功能的重要前提。由于糜酶具有广泛的底物特异性和缺乏特异性抑制剂，至今尚无理想的测活方法，也未见放免法同时测定糜酶和ACE活力的方法。
ACE活力通常用人工合成的带有发色团的三肽作为底物，通过比色法或连续分光光度法测ACE活性。该方法简单快速，但使用的底物并不是ACE的天然底物AngI，而目前糜酶样活力大多用高压液相色谱直接测定AngI的减少或Ang的产生来确定，因此难以比较分别用不同方法测定的两种酶的活力。
本文应用国产血浆肾素活性放射免疫分析测定盒及蛋白酶抑制剂首次建立了一种同时测定小鼠中ACE及糜酶活性的方法，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
糜酶转基因小鼠模型为本室建立，实验动物均为20周龄雄性小鼠，以转基因阴性小鼠作为对照。血浆肾素活性放射免疫分析测定盒、血浆Ang放射免疫分析测定盒购自北京北方生物技术研究所；AngI、丝氨酸蛋白酶抑制剂Aprotinin为Sigma产品；ACE抑制剂Lisinopril为Merck产品；其余试剂均为国产或进口分析纯。全自动g计数仪为LKB产品。
1.2 用于活力测定的鼠心ACE及糜酶样品的制备
引颈处死小鼠，取出心脏，生理盐水冲洗，吸干称重后剪碎放入预冷的20mmol/LTris-HCl，pH 7.4缓冲液中，Polytron匀浆，15 000g离心30min。分离上清，为胞浆及间质成分，含糜酶活性；将沉淀用同样缓冲液悬浮，微匀浆使之均匀，主要为膜成分，含ACE活性。Lowry法测定各样品中蛋白浓度。
1.3 ACE及糜酶样活力测定
利用不能抑制糜酶活性的蛋白酶抑制剂抑制样品中其它能水解AngI的蛋白酶活性，剩余活性被认为是糜酶样活性，主要包括糜酶活性，还含有少量与糜酶特性类似的其它一些蛋白酶活性。酶反应体系为500mL，分为四组：(1)含20mmol/LTris-HCl，pH 7.4、6ng Ang I及酶样品；(2)同1组另加Lisinopril至50mmol/L；(3)同2组并另加Aprotinin至20mmol/L及EDTA至20mmol/L；(4)不含酶样品的上述体系分别为各组的对照。加入酶样品启动反应，于37℃水浴15min，加入2.5倍体积预冷乙醇终止反应。15 000g离心30min，取上清冰冻干燥后加入400mL缓冲液(由试剂盒提供)溶解，利用血浆肾素活性放射免疫分析测定盒测定各样品中AngI的量。根据反应前后Ang I的减少量计算酶活力；不加任何抑制剂的反应中所测为总AngI降解活力，被Lisinopril抑制的Ang I降解活力为样品中ACE活力，总Ang I降解活力减去被Lisinopril、Aprotinin及EDTA抑制的活力为样品中糜酶样活力。每分钟降解1ngAng I所需酶量定义为1酶活力单位(U)。
1.4 转基因小鼠心脏局部Ang测定
取小鼠心脏，冰冷生理盐水洗净血污后剪碎，置于3mL 0.1mol/L HCl中，沸水浴10min，Polytron匀浆，15000×g离心30min，分离上清，加入2.5倍体积冰冷乙醇，沉淀30min后于15000×g离心30min，上清冰冻干燥后加入400mL缓冲液(由试剂盒提供)，用血浆Ang放射免疫分析测定盒测定Ang含量。
2 结果
2.1 转基因小鼠心脏组织中ACE及糜酶样活性
由本文方法检测了糜酶转基因阳性及阴性小鼠心脏组织中ACE及糜酶的活性，见表1。
表1 糜酶转基因小鼠及对照小鼠心脏组织中
ACE及糜酶样活力
Table1 The relative activities of ACE and chymase-like in the hearttissue of the control and chymase transgenic mice
Relative activity (U/mg protein)
ACE Chymase-like
Control
Supernatant 0.122±0.020 0.201±0.021
Pellet 0.231±0.027 0.111±0.014
Total 0.177±0.019 0.152±0.021
Transgenic mice
Supernatant 0.120±0.031# 0.363±0.094*
Pellet 0.221±0.043# 0.205±0.021*
Total 0.172±0.029# 0.274±0.071*
#: P>0.05, *P<0.05. 4 mice in each group.
从中可以看出，在心肌匀浆上清中的胞浆成分及沉淀中的膜成分中都检测到了ACE及糜酶样活性，对照小鼠心脏匀浆上清中糜酶样活性是ACE的两倍，而沉淀中则相反，ACE活性是糜酶样活性的两倍，总活力水平相差不大；在糜酶转基因小鼠心脏匀浆上清和沉淀中糜酶活力较对照小鼠明显升高，而ACE活性基本不变。该结果与糜酶转基因阳性及阴性小鼠中ACE及糜酶mRNA表达水平一致[2]。
2.2 转基因小鼠心脏局部Ang含量
实验结果显示，糜酶转基因阳性小鼠心脏组织局部Ang含量较阴性小鼠显著升高，分别为1984±184(n=7)及568±88pg/g心脏组织(n=5)，P<0.05。
3 讨论
近年来的研究表明糜酶可能是心脏局部肾素-血管紧张素系统的重要成员，其功能是将AngI转化为Ang，参与了心脏重构等多种生理功能。本研究利用转基因动物模型，发现糜酶转基因可表达出有活性的蛋白质并使转基因小鼠心脏局部Ang水平升高，从体内证明了糜酶是心脏组织中的Ang形成酶。
由于目前还未发现糜酶特异的抑制剂，组织糜酶活性难以测定。在心脏组织中可降解AngI的酶主要包括血管紧张素酶、ACE、糜酶以及其它一些丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在本实验中，我们选择了三种蛋白酶抑制剂来抑制糜酶以外的降解AngI的酶活力：EDTA可抑制血管紧张素酶和金属蛋白酶活性；Aprotinin可抑制大多数丝氨酸蛋白酶活性；Lisinopril是ACE特异的抑制剂，除可抑制样品中ACE活性外，被其抑制的AngI降解活力还反映了样品中ACE活性。尽管糜酶也是一种丝氨酸蛋白酶，但其活性不被Aprotinin抑制，也不被Lisinopril和EDTA抑制[3]；由于大多数糜酶以外的AngI降解酶活性被抑制，因此剩余的酶活性可反映样品中糜酶样活性。
竞争放免法是检测微量底物的常用方法，其特点是灵敏度高。国产检测血浆中肾素活性的试剂盒的原理是用竞争放免法检测血浆中AngI含量在肾素反应后的增加来反映肾素活性，我们利用该试剂盒，方法上稍做改进，省去血浆处理步骤，直接测量外加AngI在酶反应前后的减少量，来计算出样品中ACE及糜酶样活性。本方法检测得到的糜酶转基因阳性及阴性小鼠心脏组织中的ACE及糜酶样活性与其mRNA表达水平一致，且与心脏组织中酶反应产物Ang的水平相对应；通过本方法也可证明糜酶转基因小鼠心脏中糜酶基因可表达出具有活性的蛋白质并具有与ACE类似的功能。此外，本方法对血浆匀浆离心后的上清和沉淀两部分均进行了酶活分析，保证了数据的完整性。因此，本方法不失为一种简单、灵敏、可靠的同时检测组织中ACE及糜酶活性的方法。
致谢：感谢捷立康公司为本实验提供了高纯度ACE抑制剂Lisinopril。
基金项目：国家自然科学基金(39570297)资助项目
[1] Urata H，Healy B，StewartRW，et al.Angiotensin II forming pathway in normal and failing human heart[J].CircRes，1990，66(4):883-890.
[2] 李鹏，陈兰英.竞争性PCR检测MLC2-糜酶融合基因在转基因小鼠中的组织特异性表达[J].中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4):629-632.
[3] Urata H，Kinoshita A，Misono KS，et al.Idetification of a highspecific chymase as the major angiotensin II forming enzyme in the human heart[J].J BiolChem，1990，265(36):22348-22357.
收稿日期：2000-02-21 ；修订日期：2000-03-02 , http://www.100md.com