关键词：内皮型一氧化氮合酶；基因表达；新生大鼠心肌细胞培养； 逆转录聚合酶链式反应
摘要 根据大鼠内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的cDNA序列分别设计特异引物，用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测eNOS基因在大鼠心肌细胞和非心肌细胞中的表达，并以GAPDH为内标，用内参比法作RT-PCR定量。结果表明：eNOS基因在新生大鼠心、肾、脑等组织皆有表达，脑中最多、肾脏次之、心脏较少；在培养的新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞中，检测到eNOS基因的表达，其中在心肌细胞的表达高于非心肌细胞；培养基中不同的血清浓度对心肌细胞和非心肌细胞的eNOS基因表达无明显影响。
Expression ofEndothelial-type Nitric Oxide Synthase Gene in Cultured Neonatal Rat Cardiac Myocytes and Non-myocyte
Zhan Changde Wang Tinghuai Pan jingyun
(Department of Physiology，Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089)
The specific primers of theendothelial-type nitric oxide synthase(eNOS)and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) were designed according to their cDNA sequences.The eNOS geneexpression was assessed using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)standardized with GAPDH.The results showed that the eNOS gene was expressed in tissuesof brain，kidney，heart etc.The eNOS mRNA levels were highest in the brain tissue ，followed by descending order in kidney，and heart tissue .In cultured neonatal ratcardiac myocytes and non-myocytes，eNOS mRNA was detected.The eNOS mRNA levels incardiac myocytes were higher than that in non-myocytes.The effect of serum concentrationin cultured medium on the expression of eNOS genes in cardiac myocytes and non-myocyteswas not significant.
Key words endothelial-type nitric oxide synthase gene expression neonatal ratmyocardial cell culture reverse transcription-polymerase chain reaction
一氧化氮合酶(NOS)的异构体有三种：神经元型(nNOS，NOS1)、诱导型(iNOS，NOS2)、内皮型(eNOS，NOS3)。nNOS和eNOS是细胞中本来就存在的，属于构成型NOS(cNOS)，其活性受Ca2+和钙调蛋白的调节；iNOS活性不依赖Ca2+ 和钙调蛋白，在生理情况下，iNOS基因不表达，但在内毒素和某些细胞因子诱导下大量表达[1] 。近年来，对心肌细胞iNOS基因表达的研究较多，对心肌细胞cNOS的报道较少，迄今尚未见eNOS基因在心肌细胞表达的研究报道。我们应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，在新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞中，以GAPDH作内标，用内参比法作RT-PCR定量，检测eNOS基因的表达。
1 材料和方法
1.1新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞的培养
按Simpson等[2] 介绍的方法培养心肌细胞。实验用1～3天龄新生SD大鼠，在无菌条件下取出心室，剪成1mm3 均匀碎块，0.1%胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，加入含10%胎牛血清的M199培养液，接种于25mL培养瓶中，置37℃、5%CO2 培养箱中单层贴壁培养。用1h差速贴壁法分离心肌细胞和非心肌细胞，细胞计数，配成1×106 /mL，3ml/瓶。心肌细胞培养的最初两天，培养液中加入0.1%mmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷抑制非心肌细胞生长。
1.2 组织和细胞总RNA的提取
取30mg组织或收获3×106 细胞，用TRIzol试剂盒(美国LifeTechnologies 公司)提取组织和细胞总RNA。总RNA提取后，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，重复测定三次，计算样品总RNA浓度；OD260 ：OD280 比值在1.8～2.0之间。
1.3 引物
eNOS 寡核苷酸引物是根据Nadaud等[3] 的序列合成：上游5'-AACATG TGT CCT TGC TCG AGG CA-3'、下游5'-TTC CGG CGT CCA CCT GAT CCT AA-3'，用这对引物可扩增出长度为340bp的eNOScDNA片段；GAPDH寡核苷酸引物是根据Fort等[4] 发表的大鼠组织GAPDHcDNA序列设计合成的：上游5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3'、下游5'-TGA CCT TGCCCA CAG CCT TG-3'， 这对引物可扩增出长度为443bp的GAPDH cDNA片段。所有引物皆在上海生工生物工程公司合成。
1.4逆转录聚合酶链式反应
取同一样品总RNA 2μg分成两等份，分别用50pmol特异性的eNOS和GAPDH引物，采用SuperScript一步法RT-PCR试剂盒(美国LifeTechnologies 公司)进行逆转录聚合酶链式反应，总反应体积为50μL，RT-PCR的反应条件为：(A)cDNA合成和预变性：46℃30min、94℃ 2min进行1次循环；(B)PCR扩增：94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min进行28次循环；(C)最后延伸；72℃6min进行1次循环，共30次循环。
1.5 RT-PCR产物的检测和分析
取RT-PCR产物10μL加2μL上样缓冲液，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，80V45min，用GDS凝胶成像系统拍摄打印实验结果，条带用计算机图象分析系统扫描定量。
2 结果
2.1 eNOS基因在新生大鼠心脏、肾脏、脑中的表达
取新生SD大鼠心、肾、脑组织，提取总RNA，用RT-PCR，均检测出设计相符的eNOScDNA和GAPDH cDNA的片段，其中eNOS mRNA的含量在脑中最高、肾脏次之、心脏较低，结果见图1。
图1 NOS 基因在新生大鼠 心脏、肾脏、脑中的表达
Fig1 The eNOS gene expression in the heart,kidney,brain of neonatal rats
*P<0.05 vs brain;n=3,
±S;M:PCR Marker;Lanes 1 and 2 from heart;Lines 3 and 4 fromkidney;Lanes 5 and 6 from brain;Lanes 1 ,3 and 5,eNOS cDNA(340bp);Lanes 2,4 and 6,GAPDHcDNA(443bp)
2.2 eNOS基因在新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞中的表达
取培养两天的新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞，提取总RNA，用RT-PCR，均检测出与设计相符的eNOScDNA和GAPDH cDNA的片段；其中心肌细胞eNOS mRNA的含量较高于非心肌细胞，结果见图2。
图2 eHOS 基因在新生大鼠 心肌细胞和非心肌细胞中的表达
Fig2 The eNOS gene expression in the cultured neonatal rat cardiac myocytes andnon-myocytes.
MC:catdiac nyocyte;NMC:non-myocyte.*P<0.05 vs MC:n=3
±S;M:DNA Marker;Lanes 1 and 2 from MC;3 and 4 from NMC'Lanes 1 and3,eNOS cDNAL(340bp);Lanes 2 and 4,GAPDH cDNA(443bp)
2.3胎牛血清浓度对心肌细胞和非心肌细胞eNOS基因表达的影响
心肌细胞培养48h后，换入含胎牛血清0、1%、5%、10%的培养液，培养24h，观察到不同的血清浓度对心肌细胞和非心肌细胞eNOSmRNA水平无显著的影响，结果见图3。
图3胎牛血清浓度对心肌细胞和非心肌细胞eNOS基因表达的影响
Fig3 The effect of fetal calf serum concentration on the eNOS gene expression in thecultured neonatsl rat cardiac myocytes and non-myocytes
Lanes 1,3,5 and 7,eNOS cDNA(340bp);Lanes 2,4,6 and 8,GAPDH cDNA(443 bp);
Lanes 1 and 2,3 and 4,5 and 6,7 and 8 respectively from the culture with 0,1%,5%,10% fetalcalf serum;M:DNA Marker;n=3 ±S
3 讨论
我们用RT-PCR技术，以看家基因GAPDH作内标进行相对定量，在新生大鼠心脏、肾脏和脑均检测到eNOSmRNA，但在脑中的表达最高、肾脏次之、心脏较低，这说明eNOS mRNA在机体内的分布是广泛的，eNOSmRNA表达的丰度在不同的组织有高低之分。
最近，Ishiwata等[5] 用RT-PCR技术在成年大鼠心脏组织检测到eNOS基因的表达。但他们在在体实验中难以估计心脏eNOS基因是在心肌细胞还是非心肌细胞中表达。因为心脏由多种细胞构成，其中心肌细胞占心脏重量的75%；非心肌细胞主要是成纤维细胞和少量的内皮细胞和血管平滑肌细胞占心脏细胞数量的50%。我们用RT-PCR技术，在培养的新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞中，检测到eNOS基因的表达，其中在心肌细胞比在非心肌细胞的表达水平要高，这说明eNOSmRNA可能在各种细胞类型中都有分布，只是分布的丰度不同而已。
血清中含有多种激素和生长因子。Simpson等报道[2] 心肌细胞的肥大生长明显受培养基中血清浓度的调节；在无5-溴脱氧尿嘧啶核苷时，血清浓度调节非心肌细胞的增殖。在体、离体和分子生物学的研究提示：NO也影响心肌细胞的肥大生长和非心肌成分的分裂增殖[6] 。我们观察到不同的血清浓度对心肌细胞和非心肌细胞eNOS基因表达无明显影响，但这不排除某种激素或生长因子对eNOS基因表达的调节作用和在其它环节调节NO的产生。
参考文献
1 Kelly RA， Balligand J-F， Smith TW.Nitricoxide and cardiac function.Circ Res，1996，79；363
2 Simpson P，McGrath A，Savion S.Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart culturesand its regulation by serum and by catcholamines.Circ Res，1982，51:787
3 Nadaud S，Philippe M，Arnal J-F，et al.Sustained increase in aortic endothelialnitricoxide synthase expression in vivo in a model of chronic high blood flow.Circ Res，1996，79:875
4 Fort P，Marty L，Piechaczyk M，et al.Various rat adult tissues express only onemajor mRNA species from the glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase multigenic family.NucleicAcids Res，1985，13:1431
5 Ishiwata T，Guo F ，Naito Z，et al.Differential Distribution of ecNOS and iNOS mRNAin rat heart after endotoxin administration .Jpn Heart J，1997，38:445
6 Susic D，Nunez E，Frohlich ED.Reversal hypertrophy:an active biologic process.CurrOpin Cardiol，1995;10(5)：466 , 百拇医药