关键词：CC16基因；多态性；特应症
摘 要： 目的 研究CC16基因多态性与特应症遗传易感性之间的关系。方法 应用聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)方法，观察了42个特应症核心家系(n＝135)中CC16基因38A/G多态性的遗传分布情况,并用基于单体型的单体型相对风险关联(HHRR)和传递不平衡检验(TDT)进行关联和连锁分析。结果 HHRR关联分析显示等位基因38A与粉尘过敏，高sIgE显著关联(P分别<0.01，0.05)，TDT结果表示等位基因38A更多地传递给粉尘过敏患者(P<0.005)。结论CC16基因多态性可能在特应症遗传机制中起一定作用。
分类号： R562.25 文献标识码： A
文章编号： 1000-8861(2000)02-0132-02
Analysis of CC16 gene polymorphism in atopic patients
LI Wei-jie ,DENG Wei-wu ,GUO Xue-jun
(Department of Respiratory Medicine ， Ruijin hospital,Shanghai 200025,China)
YU Shan-chang ,LI Yun-zhu
(Department of Pedi-atrics ， Ruijin hospital ， Shanghai 200025 ， China)
HUANG Shao-guang
(Department of Respiratory Medicine ， Ruijin hospital,Shanghai 200025,China)
Abstract ： Objective To study the genetic association of CC16 gene polymorphism with atopy.Methods CC16 gene polymorphism was genotyped in 42 atopy nuclear families(n=135)by polymerase chain reaction(PCR)method and restriction fragment length polymorphism(RFLP)typing.Then the assoctation studies and linkage analysis were carried out by haplotype-based haplotype relative risk(HHRR)association study and transmission/disequilibrium test(TDT) . Results The HHRR asso-ciation studies showed signihcant association of the allele 38A with sensitiveness to flour dust mite(FDM)and sIgE(P < 0.01 ， 0 . 05 respectively) ； TDT showed significantly preferential transmission to children allergic to FDM(P<0.005) ， Conclusion CC16 gene polymorphism may play a role in the genetic susceptebility to atopy.
Keywords ： CC16 gene ； polymorphism ； atopy
特应症是机体的一种易患变态反应状态，主要表现为血清总IgE升高、过敏原皮试阳性、嗜酸粒细胞增多等,临床上常见于哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、花粉热等患者，病因尚不清楚，遗传因素可能起重要作用。本研究用PCR-RFLP法观察了42个特应症核心家系CC16基因第1号外显子的多态性，以探求CC16基因与特应症发病的关系。
1材料和方法
1.1对象特应症核心家系(发病孩子、其父母及其他亲属)42家，共135例，年龄30.1±15.8(2～72)岁，其中哮喘59例，过敏性鼻炎68例，过敏性皮炎(包括湿疹)31例，合并3种病者24例，合并前两种病者47例，先症者均由我院小儿科门诊提供，所收病例均进行过敏原皮试，血清总IgE测定(sIgE,ELISA法)和气道反应性测定(乙酰甲胆碱气道激发试验潮气法，6岁以下不作)，sIgE>150U/ml作为阳性，PC20<16mg/ml作为气道反应性阳性(AHR)。
1.2基因多态性检测常规酚—氯仿法抽提DNA。参照文献[1]设计引物,由中科院细胞所合成。反应条件为95℃-5min→35个循环(95℃-1min-58℃-1min→72℃-2min)→72℃-1min，由GerieAmpPCRSystem2400(美国PERKINELMER公司)进行。取PCR产物5μl，加10U内切酶Cfr13Ⅰ(TaKaRa公司)37℃消化1.5h.38A无酶切位点,酶切后仍为258bp，38G酶切后成为130和128两个片段。6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察，依电泳条带分析基因型。
1.3数据计算与统计学处理计算各等位基因频率,吻合度法检验是否符合Hardy-weinberg平衡。用基于单体型的单体型相对风险(HHRR)关联和传递不平衡检验(TDT)进行关联和连锁分析。上述计算和分析依照郭政等方法[2]，用他们编制的人群和家系遗传分析程序(PPAP)由计算机处理。
2结果
2.1基因频率和吻合度法检验结果PCR产物酶切后电泳条带见图1。38A等位基因频率为0.53，38G等位基因频率为0.47。吻合度检验符合Hardy-Wemberg平衡(x2＝1.843，P>0.1)。
图1CC15基因限制性片段长度多态性基因分型图
Fig1GenotypingofCC16genebyRFLP.130bpand128bparecombinedintooneband
Thegenotypesoflane1and6are38AA，thegenotypesoflane3and4are38GGandthegenotypesoflane2and5are38AG.LaneMis174-HacdisestDNAMarker
2.2HHRR和TDT分析结果HHRR分析结果显示：38A等位基因与粉尘过敏及高sIgE显著相关(HRR分别为6.25，3.9l；x2分别为7.01.4.82；P分别<0.01.0.05)，与AHR无显著关联(HRR=2.70；x2=3.46,P>0.05)。TDT检验结果显示：38A等位基因较多的传递给粉尘过敏患儿(x2=8.23，P<0.005),而与AHR及高sIgE无传递不平衡存在(P>0.05)。
3讨论
CC16是一种分子量为16kDa的蛋白质，主要由气道的Clara细胞分泌，它是一种天然的免疫抑制物,可通过干预细胞因子的不同途径起到有效的抗炎作用[3]。CC16基因位于11ql3基因标记D11S16和D11S97之间，这一区域已被证实与特应症和气道高反应性基因连锁。关于CC16基因多态性与特应症的关系，国外已有研究，但存在于盾报道。MAO等[4]对日本哮喘患者CC16基因一个微卫星多态性的研究，没有发现有相关性存在，Laing等[1]在对CC15基因与哮喘的相关研究中，发现等位基因38A与哮喘显著相关，但其研究无进行连锁分析。本研究以特应症儿童为先症者，寻求其父母及其他亲属构成小核心家系，并用HHRR和TDT进行关联和连锁分析发现：等位基因38A与粉尘过敏显著关联和连锁，与高sIgE显著相关。CC16基因38A/G多态性对CC16基因的表达和CC16的功能有无影响，尚未见报道，但38A/G多态性位置与大鼠CC16基因一个微小启动于的位置相当，实验表明：该启动子对支气管上皮CC16基因的表达有重要的调节作用[5]，因此，尽管TDT检验尚不能区分与疾病基因真正连锁或是存在连锁不平衡，但考虑到CC16的性质、功能及基因定位，可以推测，CC16基因可能在特应症的发病中起一定作用。
参考文献：
[1]LAING IA.GOLDBLATT J，EBER E et al.A poly-morphism of the CC16 gene is associated with an in-creased risk of asthmal[J].J Med Genet,1998，35(6)：463～467.
[2]郭 政，李 霞,何 颖著.医学遗传学与遗传流行病学数据分析[M].哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1996-84-93.
[3]DIERYNCK I，BERNARDA，ROELS H，et al.The hu-men clara cell protein:biobemical and biological char-acterisation of a natureal immunosuppressor[J],Mult Scler.1996.1(6)：385～387.
[4]MAO XQ，SHIRAKAWA T，KAWAI M，et al，Asso ciation between asthma and an intragenic variant of CC16 on chromose 11q13[J].Clin Genet，1998，53(1)：54～56.
[5]SAWAYA PL，LUSEDS.Twe members of the HNF-3 family have opposite effects on a ilung transcription-al element;HNF-3 alpha stimulates and HNF-3 beta inhibits activity of region 1 from the clara cell secre-tory protein(CCSP)promoter[J]，J BioI Chem，1994.22211～22216.
收稿日期：1999-08-11
修稿日期：1999-12-22
(李伟杰 邓伟吾 郭雪君 俞善昌 李云珠 黄绍光)