关键词：
血行转移是肝癌发生转移的主要途径，肝癌细胞脱 落入血是发生血行转移的前提。外周血中AFPmRNA的检 测，为预测肝癌的转移提供了新的手段。本实验采 用反转录竞争PCR法定量检测了人外周血AFPmRNA含量。
1 材料与方法
1.1 病例及细胞系的选择
选自1996年10月至1998年6月我科住院患者96例。按疾病 种类分为3组：无肝病对照组12例，肝硬化组15例及肝 癌组69例。肝癌组均经血清学检查、B型超声、CT、病 理等检查确诊。采用人类肝癌细胞系HepG2作为检测结 果阳性对照，人类胃癌细胞系作为阴性对照。
1.2 试验方法
标本采集、总RNA提取、反转录cDNA均参照有关文献进 行。
引物设计：参考有关文献及01igo引物设计软件设计 引物顺序(表1)。
表1 AFPmRNA引物序列
| 引物名称 | 引物顺序 |
| AFPmRNA引物 | |
| 上游外引物(A) | 5′-GCTGACATTATTATCGGACAC-3′ |
| 下游外引物(B) | 5′-CTCTTCAGCAAAGCAGACTTC-3′ |
| 上游内引的(C) | 5′-GCCATGCTTCAGCAGCTT-3′ |
| 上游内引物(D) | 5′-AGCCTCAAGTTGTTCCTCTGT-3′ |
| 下游突变引物(E) | 5′-TGTGCCAAGCTTAGGGTGTAG-3′ |
| 下游突变引物(F) | 5′-CTACACCCTAAGCTTGGCACA-3′ |
| β2微球蛋白引物 | |
| 上游外引物 | 5′-ACCCAGAGGTTCTTTGAGTC-3′ |
| 上游外引物 | 5′-TCTGATAGGCAGCCTGCACT-3′ |
巢式PCR：模板作10倍倍比稀释，与待测标本于一个 反应体系里进行PCR。分别用外引物A和B与内引物C和D行 PCR反应，第一次PCR反应体系容积50μl，其中含外引物 各12.5pmol、TaqDNA酶2.5单位。95℃预变性5分钟，然后93℃变 性60秒，50℃复性60秒，72℃延伸120秒，共进行32循环， 后延伸10分钟，扩增片段长度为357bp。第二次PCR：取第 一次扩增产物2μl，加入第二次反应体系中，除引物 为内引物外与第一次相同。扩增片段长度为184bp。
酶切反应：取第二次PCR产物10μl，10×酶切缓冲液2μl， HindⅢ酶5U，混匀，37℃30分钟，75℃10分钟，酶切产物长 度分别为94bp和90bp。
电泳及结果观察：2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭 染色，以pBR322/BstN1作为分子量标准，在紫外透射下观 察结果，以条带量度最接近的模板数为待测标本浓 度。
1.3 统计学方法及显著性界值
采用t检验，以P<0.05为显著性界值，以P<0.01为非常 显著性界值。
2 结果
AFPmRNA检测结果如表2。
表2 各组AFPmRNA检测结果(拷贝/ml血)
| 分组 | 总例数 | 阳性 | 阴性 |
| 对照组 | 12 | 0 | 12 |
| 肝硬化组 | 15 | 2(5.50×104 ±4.50×104 ) | 13 |
| 肝癌1组 | 21 | 6(2.35×106 ±1.53×106 )* | 15 |
| 肝癌2组 | 26 | 16(2.58×106 ±9.25×105 )* | 10 |
| 肝癌3组 | 22 | 20(2.98×107 ±9.32×106 )* | 2 |
2)肝癌1组：肝癌未发生转移组；
肝癌2组：肝癌发生肝内及局部转移组；
肝癌3组：肝癌发生远处转移组；
3)*P<0.001
3 小结
本研究在定性检测呈阳性后采用竞争PCR技术定量检 测外周血AFPmRNA。其中模板的设计参照了有关文献及 01igo引物软件，不但引进了HindⅢ酶切位点，还将此位 点设计于内引物中点附近，目的是使酶切后产物电 泳位于同一条带，易于与未酶切之标本进行比较， 结果更加可靠，这在以往文献中未见报道。
我们曾报道不同肝病患者外周血AFPmRNA的定性检测， 得出了伴远处转移的肝癌患者AFPmRNA阳性率高于不伴 远处转移患者(P<0.05)的结论。在此基础上，我们采用 竞争PCR技术对外周血AFPmRNA进行定量检测，以期从含量 上判断肝癌发生转移的危险性。从实验结果可以看 出，无肝病对照组均为阴性；肝硬化组15例只有2例为 阳性，且含量低；AFPmRNA的阳性率及含量随未转移、 局部转移及远处转移顺序而提高。肝良性病变组与 恶性病变AFPmRNA含量之间、发生远处转移与未发生远 处转移含量之间也具有非常显著性差异(P<0.0001)。说 明肝癌患者发生远处转移的危险性随外周血AFPmRNA的 含量增加而增加。提示在外周血中检测到AFPmRNA、特 别是含量较高时，要特别注意有无远处转移，必要 时可进行进一步检查与治疗，防止和(或)减缓转移的 发生。
(李雅玲校对)
本文课题受全军九五攻关科研基金资助(编号 96Q105)
(1999-12-20 收稿)
, 百拇医药