关键词：绿色荧光蛋白；基因转移；脑组织移植
【摘要】 目的 为确定外源GFP基因能否作为标记基因来追踪细胞在植入脑内后的生长情况。 方法 构建GFP基因真核表达质粒，导入PA317细胞，筛选出GFP高表达的PA317细胞克隆，移植入SD大鼠纹状体，作相应部位的组织冰冻切片，用荧光显微镜观察GFP在脑内的表达。结果 GFP高表达的PA317细胞克隆，发出强绿色荧光，被移植入SD大鼠纹状体后，仍发出绿色荧光。结论 GFP基因可以作为标记基因追踪细胞在植入脑内后的生长情况。
Intracerebral Transplantation of GFP gene-modified cells Ying Qilong, Zhu Junming, Song Houyan. Department of Molecular Genetics, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To study whether the exogenetic GFP gene can be used as a marker to trace the growth of the GFP gene-modified cells which was transplanted into brain. Method GFP gene eukaryotic express plasmids was constructed and transfected into PA317 cells. The PA317 cells much highly expressing GFP were screened and implanted into the striatum of the SD rats. Brain cryostat sections were prepared and the expression of GFP in the brain was observed using fluorescent microscopy. Result PA317 cells which highly expressed GFP showed green fluorescence. When PA317 cells were implanted into brain striatum of the SD rats, the green fluorescence was also observed. Conclusion GFP gene can be used as a marker to observe the growth of the donor cells implanted into brain.
【Key words】 Green fluorescent protein Gene Transfer Transplantation
我们通过构建GFP基因的真核表达质粒，在体外培养的细胞进行表达，并将经GFP基因修饰的细胞移植入大鼠脑内，观察GFP在脑内的表达情况。
材料和方法
1. 材料 逆转录病毒表达载体GCXPXSN和带有GFPS65T 基因的pGFPS65T 质粒为第二军医大学肝胆外科研究所钱其军博士所赠；限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自BRL公司；DMEM培养基、G418为Sigma公司产品。病毒包装细胞PA317购自中科院上海细胞所。
2. 方法 (1) GFP基因真核表达载体构建： 用 NotⅠ酶消化 pGFPS65T 质粒， 回收约700 bp的GFPcDNA片段， 将此片段与NotⅠ单酶酶解的GCXPXSN载体进行连接反应， 酶解鉴定为正向连接的克隆命名为GC-GFP-PXSN质粒。(2) 转染细胞： DNA-磷酸钙共沉淀法将GC-GFP-PXSN导入PA317细胞，G418筛选阳性克隆，在荧光显微镜下观察每个克隆的荧光发射情况。挑取荧光最亮的克隆，命名为PA317-GFP细胞。(3) 流式细胞仪检测： 收集PA317-GFP细胞，用流式细胞仪检测GFP的表达。(4) 脑内移植： 收集PA317-GFP细胞，立体定向植入SD大鼠的纹状体内，选取两个靶点，坐标为： 1.前囟前1 mm，右旁开2.5 mm,深度4.5 mm;2.前囟后1 mm，右旁开3.5 mm,深度5.5 mm。每个靶点注射1×106 个细胞。对照组注射转染GCXPXSN空载体的PA317细胞。注射后2周用4%多聚甲醛灌注动物，迅速取脑，作移植部位连续冰冻切片，厚30 μm，切片在荧光显微镜下观察。
结 果
2. GFP在PA317细胞的表达 转染GC-GFP-PXSN质粒20小时后，倾去培养液，换上PBS缓冲液，用蓝光激发，直接在荧光显微镜下观察，可见有发绿色荧光的细胞。发荧光的细胞数约占总细胞数的2-5%。经G418筛选后，细胞形成克隆，此时在荧光显微镜下观察发现，约30%的细胞克隆未见有绿色荧光，其余发绿色荧光的细胞克隆中，荧光强度差别很大。我们在荧光显微镜下挑选出发荧光最强的克隆，命名为PA317-GFP细胞，继续扩增培养。扩增后的PA317-GFP细胞，增发出较强的绿色荧光。流式细胞仪检测结果也显示，大部分PA317-GFP细胞表达GFP。
3. GFP在脑内的表达 将PA317-GFP细胞立体定向植入大鼠纹状体，2周后用4%多聚甲醛灌注动物，作相应层面的冰冻切片，立即在荧光显微镜下观察，可见移植部位有大量发射绿色荧光的细胞，而对照组未见发绿色荧光细胞。
讨 论
1994年Chalfie[1] 首次报道GFP cDNA能在异源细胞表达，随后，作为新型报道基因，GFP已越来越多地被应用于基因表达调控、转基因动物、蛋白定位、大分子之间相互作用等方面的研究[2、3] 。本实验首次证实，GFP cDNA不但可以在培养的哺乳类动物细胞中得到表达，表达GFP的细胞被移植入大鼠脑内后，仍发出绿色荧光，而且观察时无需加任何底物，直接将脑组织切片置于荧光显微镜下，用蓝光激发，即可在相应部位观察到发绿色荧光细胞。因此，我们认为，GFP cDNA可作为一个标记基因，应用于追踪和观察植入脑内的细胞生长情况。
在以往进行脑组织移植研究时，植入的细胞，特别是神经细胞，经过一段时间后，要与宿主细胞发生整合，两者难以区分，也就很难了解植入细胞的存活和生长情况。而将GFP作为标记基因转入供体细胞后，可以很方便地追踪供体细胞在脑内的生长情况。而且，由于对GFP表达的检测不需用任何底物或辅助因子，直接在荧光显微镜下就可观察，不干扰我们对供体细胞其他表达产物的检测，因而可对植入细胞的生长、功能产物表达与脑移植效果之间的关系，作出较为客观的评价。本实验研究不但对脑组织移植，对其他种类组织细胞的移植研究也有一定的借鉴意义。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39770768)
参考文献
1 Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker gene expression. Science, 1994, 263: 802-805,
2 Kain SR, Adams M, Kondepudi A, et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques, 1995, 19: 650-655.
3 何琪杨，张鸿卿，薛绍白. 活细胞的分子探针—绿色荧光蛋白. 国外医学分子生物学分册，1997， 19： 279-283.
(收稿： 1998-06-08 修回： 1998-09-20)
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