关键词:
研究表明,利多卡因可延迟缺氧大鼠的脑死亡时限,缓解家兔脑缺氧后的形态学改变,可能还有抑制胚鼠脑细胞膜上电压依赖性钙通道的作用。虽然目前仍无系统理论阐述脑缺血缺氧损伤的确切机制,但这一过程中细胞内游离钙的作用已得到确认,被称为“钙超载”假说〔1〕 。本文目的在于观察利多卡因是否对缺氧引起的细胞内游离钙水平的变化产生影响。
材料与方法
选用生后24小时内的Wistar大鼠乳鼠(北京医科大学实验动物科学部),雌雄不限。断头后分离其皮层组织,剥去软脑膜和血管,剪碎后胰酶消化,200目铜网过筛,台盼兰染色法确定其细胞存活率应>90%,以DMEM培养基(Gibco产品)制成含细胞2×106 /ml的悬液,接种于预涂小牛皮胶元(Sigma产品)的培养皿内,每皿含3ml细胞悬液,置于37℃、5%CO2 +95%空气的培养箱中孵育30分钟。然后将细胞分为三组:正常培养组(N)仍在原条件下培养;缺氧组(A)和缺氧+利多卡因组(L)置于37℃、5%CO2 +95%N2 的密封箱(自制)中继续培养,时间均为1.5小时。L组细胞培养液中含利多卡因6.9×10-5 M〔2〕 。培养结束,每皿内加入Fura-2/AM(中国医学科学院药物研究所),终浓度为5mmol/L,在37℃温箱内负载50分钟,然后将细胞悬液转移至玻璃试管,经过冲洗,在4℃、1500r/min条件下离心两次,最后加适量Hank`s液悬浮细胞,37℃温孵3分钟,用荧光分光光度计(SPEX-Flouro MAX)检测。检测条件:激发光光栅10nm,发射光光栅16nm,发射光波长500nm。固定激发光波长在340nm、380nm,分别测定加入triton-x-100、EGTA(均为Sigma产品)后的荧光值,按下列公式计算〔3〕 :
〔Ca2+ 〕i=Kd*(Ff2 )/(Fb2 )*((R+Rmin))/((Rmαx-R))
其中Kd=224nm,R、Rmax、Rmin分别为测得的荧光、最大和最小荧光比值(即340nm与380nm处的荧光强度之比),Ff2 和Fb2 分别为零钙(加EGTA后)及钙饱和时(加入triton-x-100后)380nm激发光处所测得的荧光强度。〔Ca2+ 〕i为细胞内游离钙浓度,单位为nm(1nM=10-9 mol/L)。
结果
三组之间均数比较选 用方差分析,F=27.34,P<0.001。每两组间用q进一步检验,
P<0.05。
附表 离体大鼠大脑皮层细胞在不同条件下
培养1.5小时后〔Ca2+ 〕i的变化(nM,±s)
N(培养皿数=9) | A(培养皿数=10) | L(培养皿数=9) |
106.6±4.8 | 170.1±27.8 | 140.2±14.1 |
讨论
利多卡因对于缺氧脑组织的保护作用,虽然不同作者观察的结果和解释不尽相同,但多数实验已证明,在一定条件下,利多卡因具有减轻脑组织由缺氧所致损伤的作用。其作用机制可能与下列因素有关:(1)在正常脑组织,利多卡因具有降低细胞能耗的作用,从而提高细胞对缺氧的耐受力;(2)缺氧时,利多卡因可阻断钠通道,减少由于膜上Na+ -K+ 交换而造成的过度能耗〔4〕 ;(3)利多卡因可能对膜上电压依赖性钙通道有抑制作用;(4)可能有减轻H2 O2 诱导的脂质过氧化反应的作用〔5〕 。
本文提示,利多卡因对离体大鼠大脑皮层细胞由缺氧引起的〔Ca2+ 〕i升高具有一定的抑制作用 ,这可能是利多卡因保护缺氧脑组织损伤的部分作用途径,其确切意义仍有待进一步研究。
参考文献
1 Siesjo BK ,Begtsson F .Calcium fluxes ,calcium antagonists ,and calcium-related pathology in brain ischemia ,hypoglycemia ,and spreading depression :a unifying hypothesis.J Cereb Blood Flow Metab ,1989 ,9 :127-140 .
2 杜敏逸,周源,马令嘉. 利多卡因对乳酸损害脑细胞的保护作用. 中华麻醉学杂志,1995 15 :406-408.
3 张均田,李锡明,石成璋,等. 用Fura-2/AM 测定细胞内游离钙浓度的方法. 中国药学杂志,1991 ,26 :655-658.
4 Astrup J .Energy-requiring cell function in the ischemic brain .J Neurosurg ,1982 ,56 :482-497.
5 Hara A ,Matsumura H ,Abiko Y .Lidocaine attenuates both mechanical and metabolic changes induced by hydrogen peroxide in the rat heart .Am J Physiol ,1993 ,256 :H 1478- H1485.
(收稿:1997-10-24 修回:1998-01-02)