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关键词：脑胶质瘤；多药耐药；P-糖蛋白；流式细胞仪；长春新碱
【摘要】 目的 探讨人脑胶质瘤细胞多药耐药性(MDR)的形成规律及其耐药特性。方法 采用长春新碱(VCR)在体外对人脑胶质瘤BT325细胞持续诱导获得了表现为MDR特征的人脑胶质瘤细胞模型，以MTT法测定胶质瘤细胞增殖，透射电镜行超微结构研究，通过流式细胞仪，检测培养的胶质瘤细胞与32例术后胶质瘤新鲜组织标本中P-糖蛋白的表达。结果 耐药的胶质瘤细胞BT325/VCR对长春新碱的耐受程度为其亲本细胞的24倍，对阿霉素、威猛交叉耐药，对5-氟脲嘧啶敏感。透射电镜下见BT325/VCR细胞常染色质明显，线粒体丰富，粗面内质网增多。研究表明BT325/VCR表现为P-糖蛋白介导的典型MDR。胶质瘤新鲜组织标本中，P-糖蛋白表达阳性率为37.5%(12/32)，同肿瘤的恶性程度呈正相关(P<0.01)。结论 长春新碱能够诱导人脑胶质瘤细胞产生P-糖蛋白介导的典型MDR。胶质瘤中多药耐药基因产物P-糖蛋白表达的阳性率同肿瘤的恶性程度呈正相关。应用流式细胞仪能早期发现耐药细胞，具有临床推广价值。
Establishment andcharacterization of multidrug resistance in human g lioma cell line and surgical gliomaspecimens
FAN Yimin, WANG Hongqin, LI Baoyu, et al.
Department of Neurosurger y, The First Clinical College of Shanxi Medical University, TaiYuan 030001
【Abstract】 Objective To try to explainthe machanims and characteristics of multidrug resistance in human glioma and to inv estigate the clinical significance of predicting the responsiveness of individual gliomacells to chemotherapeutic agents. Methods Multidr ug resistant gliomasubline was isolated from BT325 human glioma cell line under selection pressure of vincristine. The human glioma cells growth was measured b y MTT assay in vitro. Electronictransmission microscope was used to e xamine the fine str ucture of cultured human gliomacells. The expression of P-glycoprotein in cult u red human glioma cell line and 32surgical glioma specimens was tested by flow c ytometer with P-glycoprotein monoclonalantibody JSB1. Results The multidrug resistant glioma subline-BT325/VCRwas resisted to vincrist i ne, 24 times as high as that of BT325 human glioma cell line,and also significa ntly resisted to adriamycin and teniposide, but sensitived to fluracil.Under e l ectronic transmission microscope, the BT325/VCR subline was documented to berich in m itochrodria, rough endoplasmic reticulum and euchromatin. The BT325/VCR cell line showed a overexpression of P-glycoprotein and P-glycoprotein medicated typic almultidrug resistance phenotype. In 32 surgical glioma specimens, there was no e vidence ofcomplete absense of P-glycoprotein, with a definifion of more than 3 7 .5%(12/32) of P-glycoprotein as positive. Significant positive correlation bet we en the positive rateof P-glycoprotein expression and the degree of tumour mali g nancy were also found. Conclusions Vincristinecould ind u ce P-glycoprotein mediated typical multidrug resistance. Multidrug resistancen a turally occurred in many human gliomas, and well correlated between the positiveexpression rate and the malignancy in glioma. The flow cytometer assay for P-g lycoprotein detection might be preferable to determinations of multidrug resistan t gliomacells, thereby be beneficial for the design of treatment protocols.
【Key words】 Glioma Multidrug resistance P-glycoproteinFlow cytometer Vincristine
恶性胶质瘤化疗失败的主要原因之一为肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药性(Multidrugresistance, MDR)。MDR即对一种化疗药物耐药的肿瘤，同时对另外一些与之化学结构、作用机制完全不同的化疗药物的交叉耐药。典型的MDR是由一种被多药耐药基因(mdrl)编码的膜糖蛋白——P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过度表达所致[1，2] 。研究胶质瘤多药耐药细胞形成规律及其耐药特性，有助于深入认识肿瘤MDR机理和寻找新的治疗对策。
材料与方法
1.材料来源： P-糖蛋白单克隆抗体JSB-1购自英国BMB公司，MTT为Sigma产品。人脑多形性胶质母细胞瘤细胞株BT325引自北京市神经外科研究所。全部组织标本选自1996年6月～1997年3月间在我院住院手术的脑胶质瘤患者。
2.实验方法： 人脑多形性胶质母细胞瘤BT325细胞株常规无菌培养。采用逐级递增培养液中长春新碱的浓度，使其产生多药耐药[3] 。采用改良的MTT法[4] ，检测细胞生长及对化疗药物的耐药性。药物诱导过程中，在倒置显微镜下直接观察细胞形态变化。收集BT325及BT325/VCR细胞，固定，包埋，制片，采用透射电镜观察。流式细胞仪检测脑胶质瘤细胞P-糖蛋白表达[5，6] 。
3.统计分析： 应用Foxbase建立数据库，由SPSS统计软件行相关及回归分析，组间显著性检验用SAS统计软件处理。
结果
1.人脑胶质瘤细胞耐药性的建立： 对VCR敏感的BT325细胞，用MTT法测得其IC50为9.1812ng/ml，实验中选用5ng/ml的VCR为初始诱导浓度，经过3个半月的持续诱导，得到在VCR浓度为200ng/ml中生长良好的BT325/VCR细胞，用MTT法测得其对VCR的IC50为224.5ng/ml，对VCR的耐受程度为BT325细胞的24倍。BT325/VCR细胞无药培养4周后，对VCR的耐药性未见明显降低，其IC50为206.99。存活细胞仍保持在90%以上(图1)。
2.细胞生长曲线及群体倍增时间： 以培养第3至11天的细胞数作图，绘制出细胞生长曲线。胶质瘤BT325细胞生长曲线的直线方程为Y=-3.76+1.96X，相关系数γ=0.95，倍增时间为51.12小时。BT325/VCR的细胞生长曲线的直线方程为Y=-3.44+1.73X，相关系数γ=0.94，倍增时间为56.16小时。表明BT325/VCR细胞产生耐药性后，其增殖能力未受到明显影响(图2)。
VCR浓度(ng/ml)
图1 VCR对胶质瘤细胞的生长抑制曲线
时间(天)
图2 胶质瘤细胞的体外增殖曲线
3.一般形态及超微结构研究： BT325、BT325/VCR细胞均贴壁生长，形状不同，大小较均匀，光镜下两种细胞形态无差异。在VCR诱导期间，随着VCR剂量逐渐增加时，细胞形态变化不明显，当VCR剂量跨度过大时，细胞大多被杀伤，细胞皱缩，稀疏。透射电镜下，BT325/VCR细胞核多分叶状，常染色质明显，粗面内质网增多，线粒体丰富。
4.耐药细胞对化疗药物的交叉耐药性： 耐VCR的胶质瘤细胞BT325/VCR表现为典型的MDR特性，即对蒽环类和植物碱类药物阿霉素和威猛有交叉耐药性，耐药程度分别是BT325细胞的38倍和21倍，而对抗代射药物5-氟脲嘧啶无交叉耐药性。用MTT比色分析法测得结果如表1所示。
5.多药耐药基因表达产物P-糖蛋白的检测： 使用抗P-糖蛋白单克隆抗体JSB-1对BT325/VCR和BT325细胞进行流式细胞仪检测，发现亲本细胞(BT325)由于没有或很少P-糖蛋白表达，不能结合JSB-1单抗，荧光强度非常低，而耐药细胞有P-糖蛋白的过度表达，荧光强度明显增强，曲线右移，表示胶质瘤细胞经VCR诱导耐药后，有mdrl基因产物P-糖蛋白的过度表达，这种差别，达100倍之多，能清楚地在流式图上表现出来。应用上述流式细胞术条件，检测32例胶质瘤组织标本，结果见表2，提示脑胶瘤组织中p-糖蛋白的表达与肿瘤的恶性程度呈正相关(P<0.01)。
表1 BT325、BT325/VCR对化疗药物的耐药性
| 化疗药物 | IC50 (ng/ml) | RF | |
| BT325 | BT325/VCR | ||
| VCR | 9.18 | 224.45 | 24 |
| ADM | 20.15 | 736.80 | 38 |
| VM26 | 71.74 | 147.76 | 21 |
| 5-Fu | 19.67 | 22.48 | 1 |
表2 P-糖蛋白在32例原发性胶质瘤中的表达
| 病理学诊断 | 总例数 | 阳性例数 | 阳性率 |
| 星形细胞瘤Ⅰ～Ⅱ级 | 12 | 2 | 16.7% |
| 星形细胞瘤Ⅱ～Ⅲ级 | 9 | 2 | 33.3% |
| 星形细胞瘤Ⅲ～Ⅳ级 | 10 | 7 | 70.0% |
| 室管膜瘤 | 2 | 0 | — |
| 少枝胶质细胞瘤 | 1 | 0 | — |
| 多形性胶质母细胞瘤 | 1 | 1 | — |
| 合计 | 32 | 12 | 37.5% |
讨论
我们应用VCR对人脑胶质瘤BT325细胞株，进行低浓度逐级递增化疗药物持续诱导，获得了表现为MDR特征的人脑胶质瘤细胞模型。采用流式细胞术，检测病人手术后胶质瘤标本中P-糖蛋白的表达，可以预测胶质瘤对化疗药物的敏感性。因此，为胶质瘤化疗提供了理论依据和具体措施[1，2] 。
BT325/VCR在体外诱导培养了5个月，能在200ng/ml浓度的VCR培养液中持续增殖，对阿霉素，威猛都有一定的耐药性。透射电镜下见细胞常染色质明显，线粒体丰富，可见许多粗面内质网，提示细胞代谢旺盛，随着耐药性产生，其酶类蛋白的合成也在增加。本实验发现VCR诱导剂量跨度过大时，瘤细胞被杀伤，提示肿瘤中大多数细胞在化疗初期还不能产生明显的药物耐受性。因此，能在化疗初期就施于较大剂量的突击性化疗，有利于预防和延缓临床耐药性的发生。
此外我们还观察到对VCR、阿霉素和威猛交叉耐药的脑胶质瘤细胞对5-氟尿嘧啶并未发生交叉耐药。这提示我们，在设计脑胶质瘤联合化疗方案时，除考虑到恶性肿瘤细胞增殖动力学的特点和化疗药物生化靶点的差异等因素外，还应考虑到避免联合应用能被同一耐药机理所交叉耐药的化疗药物。
肿瘤细胞多药耐药的分子生物学基础，为肿瘤多药耐药基因(mdrl)的扩增与该基因编码的ATP依赖性糖蛋白—P-糖蛋白的过度表达。P-糖蛋白分子形成一个ATP依赖性膜泵样结构，当有关抗肿瘤药物进入耐药细胞后，P-糖蛋白即与耐药分子相结合，同时其核苷酸结合位点与ATP结合。ATP水解后释放的能量，使药物主动地转运至细胞外，由此形成MDR[7，8] 。
我们的研究结果表明长春新碱能够诱导胶质瘤细胞产生多药耐药性。我们建立的胶质瘤多药耐药细胞，具有P-糖蛋白的过度表达。其耐药机理为P-糖蛋白介导的MDR[2，7] 。这对我们以后深入进行细胞和分子水平研究胶质瘤的多药耐药机制具有重要价值，也是体外筛选化疗增敏剂，克服胶质瘤多药耐药性不可缺少的工具。
本实验结果还提示，多药耐药现象在部分胶质瘤中先天存在。同一类型肿瘤分化程度不同其P-糖蛋白的表达量也不相同。分化好的胶质瘤P-糖蛋白表达量要明显低于分化差或中等分化的胶质瘤，与分化差的胶质瘤对化疗不敏感是一致的。
本实验直接应用胶质瘤患者手术后组织标本确定实验条件和鉴别多药耐药细胞的参数，建立了临床脑胶质瘤P-糖蛋白表达的流式细胞仪检测方法，故可直接用于临床，及早发现耐药细胞。临床医生可以根据患者P-糖蛋白表达情况，确定肿瘤细胞是否会产生耐药性，避免与多药耐药有关的化疗药物对患者造成毒副作用。
参考文献
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(收稿：1998-09-01)
, 百拇医药