关键词：肾细胞癌；多药耐药；P糖蛋白；DNA拓扑异构酶Ⅱ
【摘要】 目的 从细胞膜和细胞核水平对肾癌多药耐药机制进行探讨。方法 应用免疫组化方法对肾癌MDR的主要耐药指标P糖蛋白(P-gp)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)进行检测。结果 88.9%的正常组织及65.7%癌组织有P-gp表达，阳性染色位于正常近曲小管上皮或癌细胞膜和部分胞浆，表达强度与分级、分型无关，高期癌表达较低期癌强。21.4%的癌组织TopoⅡ表达阳性(TopoⅡ值≥100)阳性染色均位于胞核。表达1种耐药指标者(P-gp阳性或TopoⅡ<100)占42.9%，2种耐药指标者占52.9%，4.2%(3/70)无耐性指标表达，两者之间存在负相关关系。结论 各型肾癌P-gp高表达，发挥药物排出泵的作用而产生MDR。肾癌TopoⅡ表达值显著降低，使大多数化疗药物丧失了作用靶点而产生MDR。选择P-gp低表达同时TopoⅡ高表达的患者并且针对不同MDR机制采用不同的化疗药物进行化疗将有助于提高化疗有效率。
Expression of P-glycoprotein and topoisomerase Ⅱ in primary renal cell carcinoma and its clinical implication
ZHANG Qiang ,CHEN Zhifu ,SHI Zuolin ,et al .
(Department of Urology ,Fujian Provincial Hospital ,Fuzhou 350001)
【Abstract】 Objective Toexplore the mechanisms of multidrug-resistance (MDR) of renal cell carcinoma (RCC) atlevels of cellular membrane and nucleus. Methods By using immunohistochemistry, the main drug-resistant markers for RCC MDR, P-glycoprotein (P-gp)and topoisomerase Ⅱ (Topo Ⅱ) were detected in 70 cases of RCC. Results 88.9%normal kindey tissue and 65.7% RCC expressed P-gp. Higher stage RCC had a higher level of P-gp. 21.4% of RCC also had the expression of Topo Ⅱ, but only the nuclei had thepositive staining. In RCC cases, 42.9% had the expression of one resistant marker, 52.9%had two. Conclusion P-gp represent an efflux transporter that extrudesa broad spectrum of anticancer drugs from the cell, which produce the MDR. Because of thedownregulation of Topo Ⅱ, most of chemotherapy drugs lose their targets to result in MDR. The patients with low level of P-gp as well as high index of Topo Ⅱ is the bestindication of chemotherapy.
【Key words】 Renal cell carcinoma Multidrug-resistance P-glycoprotein TopoisomeraseⅡ
我们应用免疫组织化学方法，在蛋白水平通过检测mdr1 基因产物P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ, TopoⅡ)的表达，同时从细胞膜和细胞核两个不同的结合部位和两种不同的作用机制入手，结合肾癌的临床分型、分级和分期研究肾癌多药耐药的机制，结果报道如下。
对象和方法
1. 病例材料 我院1987年5月～1997年3月经病理证实的肾癌根治术70例标本，其中男性51例，女性19例，平均年龄51岁(10～80岁)。福马林固定，石蜡包埋。透明细胞癌43例，颗粒细胞癌11例，混合细胞癌(透明+颗粒细胞癌)14例，乳头状癌2例；Robson分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期42例，Ⅲ期9例；Gleason分级： 1级22例，2级24例，3级17例，4级7例。27例正常肾组织(包括远离肾癌组织的正常肾组织18例，肾结石2例，肾血管平滑肌脂肪瘤7例)作对照组。
2. 免疫组化 一抗单克隆抗体为鼠抗人P-gp(JSB1 )、TopoⅡ，均为美国MAXIM公司产品，免疫组化染色采用S-P法，分别用已知阳性的结肠癌和膀胱癌作阳性对照，用体积分数10%正常动物血清代替第一抗体作阴性对照。
3. 实验步骤 切片脱蜡、水化；加50 μl过氧化氢甲醇阻断过氧化物酶后，微波修复抗原(P-gp)10分钟、高压热力修复抗原(TopoⅡ)2分钟；加50μl体积分数为10%胎牛血清，室温孵育10分钟；加50 μl第一抗体，室温孵育60分钟；加50μl第二抗体，室温孵育10分钟；加50 μl链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，室温孵育10分钟；加100μl新鲜配制DAB或AEC溶液显色。以上各步骤之间均用缓冲液冲洗3次，共15分钟；苏木素或核快红复染、脱水、透明、封片，镜下观察。
4. 结果评估 P-gp阳性判断标准根据其阳性细胞数量和染色强度分为阴性、+、、，<5%为阴性；TopoⅡ判断标准：以两人双盲计数5个高倍镜视野，共1000个癌细胞，用阳性细胞数作为TopoⅡ表达值(两人计数值相差<5%为有效计数)，阳性为≥100，阴性为<100，为便于统计按表达强度分为4组，I级<50，Ⅱ级50～99，Ⅲ级100～199，Ⅳ级≥200。
5. 统计学方法 使用SAS计算机软件，应用非参数方法包括Ridit分析法，Kendall法RXC列联表相关分析、Kruskal-Wallis统计分析。
结 果
2. 肾癌P-gp、TopoⅡ的表达 46/70(65.7%)例肾癌有P-gp表达，阳性颗粒主要位于癌细胞膜及部分胞浆，着色不均，胞核无表达；70例肾癌组织均有不同程度TopoⅡ表达，以TopoⅡ值≥100为阳性标准则仅21.4%(15/70)肾癌表达阳性，阳性染色仅位于细胞核内，其余55/70(78.6%)例表达阴性(TopoⅡ值<100)。正常肾组织P-gp表达均强于肾癌组织(P<0.05)。因正常肾组织与肾癌组织TopoⅡ表达部位不同，因此未作比较。
3. 肾癌P-gp、TopoⅡ表达与临床分型、分级、分期的关系 采用Ridit分析法显示P-gp表达与分型、分级无关，但不同分期的P-gp表达不同，分期高的组高于分期低的组；TopoⅡ表达用Kruskal-wallis检验发现TopoⅡ表达与分型、分期无关，但分级不同TopoⅡ表达水平也不相同，分级高的组TopoⅡ表达水平高。
4. 肾癌P-gp、TopoⅡ表达之间的相关关系 本组70例肾癌表达1种耐药指标(P-gp阳性或TopoⅡ<100)为42.9%(30/70)，同时表达2种耐药指标为52.9%(37/70)，无耐药指标表达者4.2%(3/70)。Kendall法RXC列联表相关分析显示P-gp、TopoⅡ表达呈负相关关系，u=21,P<0.05。
讨 论
本组70例肾癌除乳头状癌因例数偏少，无统计学意义，其余各型肾癌P-gp表达率差异无显著性(P>0.05)，即P-gp表达与肾癌分型无关，同时提示肾癌多为天然性耐药。本组研究结果表明P-gp表达与癌细胞分级无关(P>0.05)，这说明P-gp表达与癌细胞增殖、分化无明显关系，肿瘤的异型性大小并不能代表它的耐药性。统计表明本组70例肾癌分期越高，P-gp表达也越高，我们认为P-gp高表达与肿癌侵袭力密切相关，P-gp不仅是肾癌MDR的重要指标，而且是估计临床肿瘤转移及预后的指标。总之，P-gp的高表达是肾癌MDR各种机制中最突出、最普遍的变化。
2. TopoⅡ在肾癌中表达及意义 本研究中正常肾组织胞浆和部分胞核均有TopoⅡ表达，70例肾癌组织仅21.4%(15/70)为阳性[1] ，提示肾癌TopoⅡ表达显著降低，使大多数化疗药物(TopoⅡ抑制剂)丧失重要靶点，无法通过抑制TopoⅡ而发挥作用。化疗有效所必需的TopoⅡ值仍有待进一步探讨，本组若以低于100为界值，则78.6%(55/70)的肾癌将产生MDR。因此，我们认为肾癌TopoⅡ值较其他肿瘤均显著降低，这可能是肾癌细胞本身一个重要特性，是肾癌产生MDR的一个相当重要且相当突出的一个指标。若能提高肾癌TopoⅡ表达水平，可能使大部分肾癌能够逆转MDR，对TopoⅡ值≥100的肾癌进行化疗，尤其是同时是P-gp阴性的病人可能会获得满意的效果。
3. 肾癌P-gp、TopoⅡ表达之间的关系 本组70例肾癌P-gp表达与TopoⅡ表达之间呈负相关关系，我们推断这两大耐药指标表达是同时由某一共同机制调控，不同的表达方式只是由于它们在不同组织类型中癌基因变化或肿瘤发展的生物学特性的不同所致。
参考文献
1 Noritaka Y, Hironoba S, Katsuaki K, et al. Immunohistochemicalstudy of DNA topoisomeraseⅡ in human gastric disorders. Am J Path, 1996，149:977-1007.
(收稿：1998-11-16 修回：1999-04-24)
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