p16基因是1994年由Kamb和Skolnick^[1] 率先报道的一种新型抑癌基因。新近研究发现，它的失活与多种肿瘤的发生发展过程有着至关重要的关系。我们采用免疫组织化学(免疫组化)和聚合酶链反应(PCR)方法对非霍奇金淋巴瘤(NHL)进行p16基因的蛋白表达和失活检测，并同步对比Rb的蛋白表达，以探讨p16基因在NHL中的意义。

1 标本 47例NHL的石蜡包埋标本，取自第一军医大学南方医院1994～1997年的病理档案。10%甲醛固定，石蜡包埋，4～5μm厚制片，HE染色。并做LCA、UCHL-1、L26、Mac387免疫组化染色，进行免疫表型分类，结合HE形态按1985年成都会议修订的NHL分类方案^[2] 阅片分类，其中高度恶性12例,中度恶性16例,低度恶性19例。
2 抗体 p16蛋白多克隆抗体(按1∶30稀释)及pRb蛋白多克隆抗体(按1∶60稀释)均为美国SantaCruz生物技术公司产品。LSAB试剂盒为福州迈新生物技术开发公司产品。
3 免疫组化 按LSAB试剂盒说明进行。
4 结果判定 阳性表达以细胞内出现明显的棕色颗粒为判断标准。采用双评分半定量法:<25%瘤细胞阳性为0分，25%～50%为1分，50%～75%为2分,>75%为3分，显色度按切片中细胞显色有无及深浅计分，细胞无显色0分，淡黄色1分,棕黄色2分，棕褐色3分，将两分相加，1～2分判(+)，3～4分判(++)，5～6分判(+++)。阴性对照用PBS代替抗体。
5 统计学分析 采用χ² 检验及Spearman相关(等级相关)分析,检验水准定为0.05。
6 DNA提取 连续切片2～5张，裱在载玻片上二甲苯脱蜡2次，无水乙醇洗去二甲苯，电扇吹干。对照光镜下HE染色切片，用刀片最大程度去除组织中的正常和坏死组织。剩余组织刮入Eppendorf管中，加入50～100μl消化液(50mmol/LTris,1mmol/L EDTA,0.5% Tween20，100μg/ml蛋白酶K)，52℃孵育过夜，煮沸10分钟，离心(10?000～12?000r/min)沉淀未消化组织，取上清液为PCR模板。
7 PCR反应 用两对引物，分别扩增外显子1和2。为了确定模板DNA的质量，采用β-actin基因的扩增产物为参照物。3对引物的序列及PCR扩增条件参考Washimi等介绍的方法^[3] 。该3对引物由陈艺华教授在美国合成赠送。扩增体系为25μl反应体系包括DNA模板5μl(约100～200ng)、1UTaq DNA聚合酶(加拿大真达公司产品)及1μmol/L引物等。反应在Hema-480扩增仪(珠海黑马公司产品)中进行。扩增结束后，72°C延伸10分钟，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1 p16及Rb染色特征
1.1 在NHL瘤组织中，p16蛋白定位于胞浆中，阳性产物呈弥漫或散在棕黄色分布，阳性细胞在各型NHL中分布无明显特征，且表达有异质性。
1.2 在NHL瘤组织中，Rb蛋白一般定位于胞浆中，部分细胞核中也有表达，阳性产物呈弥漫或散在棕黄色分布。
2 p16表达及与Rb表达关系
2.1 p16蛋白在不同恶性程度的 NHL中的表达情况见表1。
由表1可见，随着恶性程度的增加，p16表达明显降低，其中高度恶性与低度恶性p16阳性率有明显差异(P<0.05)，高度恶性与中度恶性阳性率也存在明显差异(P<0.05)，但中度恶性与低度恶性之间差异不显著(P>0.05)。

p16蛋白是周期依赖激酶4的抑制剂(CDK4I)，它结合到CDK4/周期蛋白复合物上抑制了它的活性，阻滞了视网膜母细胞瘤易感基因产物pRb的磷酸化，使其保持活性状态，细胞不能从G₁ 期进入S期，起到了防止细胞增殖的作用^[4] ，它的失活将导致细胞无限制生长和肿瘤的形成。
本实验中47例NHL p16蛋白阳性率为44.7%，比张尚福等^[5] 报道的阳性率(37.8%)稍高，可能与样本数，尤其是样本中高、中、低度恶性NHL所占比例有关。另据文献报道，高度恶性NHL的发病与p16基因活性有关^[6] 。我们发现p16蛋白在不同恶性程度的NHL中的表达有一定差异，高度恶性NHL在p16蛋白表达上与中、低度恶性NHL有显著差异(P<0.05)。其表达对于病理诊断及恶性程度的判断有一定的意义。本实验中，38例Rb表达阳性中23例p16阴性，而9例Rb阴性中6例p16阳性,经Spearman相关分析，r=-0.2978,P<0.05，表明二者之间呈明显负相关。提示p16与Rb基因对细胞周期的负反馈调节作用在NHL的发生发展中可能也有一定的意义。
我们还发现，47例中6例出现纯合性缺失，p16蛋白表达阴性，6例纯合性缺失均为高度恶性NHL，进一步证实p16基因是一种重要的抑癌基因，它的失活同肿瘤的恶性化有着密切的关系^[6] 。

1 Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulatorpotentially involved in genesis of many tumor types. Science,1994,264:436-440.
2 徐世麟.介绍1985年成都会议上修订的非何杰金氏淋巴瘤工作分类方案及诊断指标.淋巴瘤学刊，1985,8:2-6.
3 Washimi O,Nagatake M, Osada H,et al. In vivo occurrence of p16(MTS1) and p15(MTS2)alterations preferentially in non-small cell lung cancers.Cancer Res,1995,55:514-517.
4 Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and p16 INK4expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res， 1995，55：505-509.
5 张尚福，李俸媛，石砚，等. p16蛋白表达与非何杰金氏淋巴瘤的关系.华西医科大学学报，1996，27：254-257.
6 Ogawa S,Hangaish A,Miyawaki S, et al. Loss of the cyclin-dependent kinase 4-inhibitor(p16;MTS1)gene is frequent in and highly specific to lymphoid tumors in primary humanhematopoietic malignancies. Blood,1995,86:1548-1556.