关键词：树突细胞；造血细胞生长因子；造血干细胞；单核细胞
【摘要 】 目的 体外大量扩增和纯化具有典型表型、形态和功能的树突状细胞(DC)，以进行相关基础研究和临床应用。方法 采用免疫磁珠法分离脐血CD34 + 细胞及外周血去B、去T淋巴细胞的单个核细胞(单核细胞)，然后以GM-CSF、IL-4、TNF-α、Flt3配基(FL)、SCF等不同的细胞因子配伍，分别诱生DC，通过流式细胞仪、电镜、光镜分析其特性，同时检测其刺激同种T细胞增殖的能力。结果 脐血与外周血诱生DC的方案不同，由脐血CD34 + 细胞诱导DC时，GM-CSF+TNF-α+SCF+FL组合可使CD1a + 细胞比例增至(27.18±1.56)%，明显高于单独应用GM-CSF组[(0.65±0.38)%]。外周血单核细胞诱导的DC，则GM-CSF+高剂量IL-4(1000 U/ml)组合效率最高，诱生的CD1a + 细胞可达(21.80±0.32)%。两种来源的DC在表型及形态上差异无显著性，两者同样具有刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结论 从脐血和外周血均可诱生DC，根据应用目的的不同对其进行选择，这为DC用于临床治疗选择不同细胞来源提供了实验基础。
Studies on the properties ofdendritic cells from cord blood CD34 + cells and peripheral bloodmonocytes
WANG Xiao, PEI Xuetao, LI Liang, et al.
Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850
【Abstract 】 Objective Exvivo expansion and purification of dendritic cells(DC) with typical phenotype, morphologyand function are critical to the further studies on DC and their clinical application. Methods CD34 + cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cellsorting system (MACS), and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were depleted of Tand B cells by mixing them with T/CD2 and B/CD19 magnetic beads. DCwere induced and expanded with different combinations of cytokines. They were identifiedfor their properties by FACS, electronic microscopy, microscopy, and mixed lymphocytereaction (MLR). Results Cultures of cord blood CD34 + cells with the combination of GM-CSF+TNF-α+SCF+FL yielded (27.18±1.56)% CD1a + cells, much higher than that (0.65±0.38)% with GM-CSF alone. The combination of GM-CSFand high dose IL-4(1 000 U/ml) was the most potential for expanding CD1a + cells [(21.8±0.32)%] for PBMC. Both of the DC from different sources were similar inphenotype and morphology, and had the capacity to stimulate proliferation of allogeneic Tlymphocytes. Conclusion Both of cord blood and peripheral blood arethe source for generation of a large number of typical DC, and can be adopted for theapplication according to different purposes. These results lay foundation for theimmunotherapy with DC.
【Key words 】 Dendritic cells Hematopoietic cell growthfactors Hematopoietic stem cells Monocytes
树突状细胞(dendritic cell , DC)因其专职递呈抗原、刺激体内初始T细胞，在免疫应答的诱导中具有独特的地位[1] 。DC在组织中含量甚微，其来源的困难限制了研究的深入。近年来有关DC诱生方案的探讨已成为热点，其中包括寻求DC合适的来源、最佳的细胞因子配伍及应用顺序、完善的培养条件等。因前体细胞来源不同，采用的细胞因子也不尽相同[2，3] 。目前，从DC典型的形态、膜表面表达的主要组织相容性抗原复合物Ⅱ(MHCⅡ)类分子、能移行至淋巴器官和刺激初始T细胞增殖活化，及其特异性表面标志等可确认DC[4] 。诱生方案成熟后，可根据不同目的选择不同细胞来源诱生DC，开展DC在肿瘤、感染、移植免疫、自身免疫等方面的研究，从而为实现DC的临床应用创造条件。
材料和方法
1 材料 MiniMACS磁性分离仪为德国MiltenyiBiotec公司产品；Coulter免疫磁性分离仪Coulter Immunotech生产；流式细胞仪为美国FACScanBDIS产品；钴源为军事医学科学院提供；液闪计数仪为Beckman产品。脐血及外周血均采自解放军总医院。GM-CSF为Glaxo产品；IL-4为Promega产品；TNF-α为Genzyme产品；SCF为Sandos产品；FL为Immunex产品。
单克隆抗体(单抗)CD34 QBEND/10为Miltenyi Biotec产品；PE标记鼠抗人CD1a 单抗、FITC标记鼠抗人CD80 单抗和FITC标记鼠抗人HLA-DR单抗，购自深圳晶美生物工程有限公司；免疫磁珠吸附的CD2 、CD19 单抗为CoulterImmunotech产品；免疫磁珠吸附的DC单抗为Coulter Immunotech产品。
2 脐血CD34 + 细胞的分离纯化 采用MiniMACS免疫磁性分离系统进行[5] 。脐血(CB)经5g/L的甲基纤维素沉降，经Ficoll(相对密度为1.077)梯度离心分离出单个核细胞(CBMNC)，洗涤后标记抗体与磁珠(抗CD34 抗体为QBEND/10，磁珠为羊抗鼠IgG1 免疫磁珠，均为1∶5稀释)。标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时，洗脱除去CD34 - 细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集组分为CD34 + 细胞。
3 外周血单核细胞的分离纯化 采用Coulter吸附单克隆抗体-磁珠阴性选择系统。按上述方法从外周血中分离单个核细胞(PBMNC)，以T、B淋巴细胞特异性CD2 、CD19 单抗-磁珠标记细胞，置于磁场中用以去除T、B淋巴细胞，待细胞悬液的上清清亮后(约10分钟)，吸取上清，用缓冲液离心洗涤，收集到的细胞即为单核细胞。
4 树突状细胞的诱导 脐血CD34 + 细胞与外周血单核细胞以5×103 /ml接种于12孔板中，每孔1ml。培养体系IMDM含体积分数为12.5%的HS和FCS、5×10-7 mol/L氢化考的松以及不同组合的GM-CSF(40 ng/ml)、TNF-α(50 U/ml)、SCF(100 ng/ml)、FL(40 ng/ml)和IL-4(400 U/ml、1000 U/ml)。37 ℃、体积分数为5%的CO2 条件下培养，每周半量换液。
5 流式细胞仪检测细胞表型 CD1a 与HLA-DR均采用直接标记法，将细胞分成不同组别，CD1a 为PE荧光标记，CD80 和HLA-DR为FITC荧光标记，抗体以1∶10稀释，4℃孵育30分钟，洗涤两次，重新悬浮后用流式细胞仪检测。
6 电镜分析 透射电镜观察：DC悬液离心，细胞沉淀用体积分数为4%的戊二醛和体积分数为1%的锇酸固定，梯度乙醇脱水，经超薄切片铅铀染色后，透射电镜观察并摄片。扫描电镜观察：DC悬液用PBS洗两次，体积分数为4%的戊二醛固定后，PBS洗1次，制成悬液滴片，体积分数为1%的锇酸固定，梯度乙醇脱水，扫描电镜观察并摄片。
7 DC刺激同种T细胞增殖反应
7.1 分离纯化T淋巴细胞： 采用Coulter CD2 免疫磁珠阳性选择系统分离T细胞。人外周血单个核细胞1×107 /ml与100 μl CD2 磁珠混匀，作用10分钟后置于磁场中，待上清清亮后，移弃上清，将细胞移出磁场，充分洗涤吸附于管壁上的细胞，此为阳性选择的T细胞，用作同种T淋巴细胞增殖反应。
7.2 DC刺激同种T细胞增殖反应：DC与PBMC以每孔1×103 ，3×103 ，1×104 接种于96孔板，每组3个复孔，经60 Coγ射线照射灭活(3 000 cGy)，然后每孔加入1×105 T淋巴细胞，共培养4天，于培养结束前16小时加入3 H-TdR,18.5kBq/孔，反应结束时收集细胞，液闪计数仪检测放射性核素每分钟闪烁计数值。
8 统计学处理 采用两样本均数比较的t检验。
结 果
1 细胞因子配伍对DC生成的影响 脐血CD34 + 细胞为造血干/祖细胞，外周血单核细胞含有向DC分化的髓系前体细胞，二者在细胞因子作用下经两周的培养均可向DC定向诱导分化。脐血CD34 + 细胞单独加入GM-CSF体外培养时，以生成单核细胞为主，CD1a + 细胞仅占(0.65±0.38)%，而不同的细胞因子组合可使CD1a + 细胞的比例增至(4.12±0.60)%～(27.18±1.56)%(组间比较，P<0.01)。结果表明，不同细胞因子配伍对DC的诱导效率显示出差异，TNF-α(50U/ml)为脐血CD34 + 细胞定向诱导DC所必需，它可加速DC的成熟；在GM-CSF+TNF-α的组合中加入SCF或FL，对脐血DC的诱生有明显的协同作用，CD1a + 细胞的比例分别增加至(12.3±0.33)%和(18.0±0.11)%，FL的作用更为明显。
IL-4的量对DC的诱生效率有很大影响，400 U/ml以下诱生的细胞，CD1a + 细胞仅占(3.30±0.16)%，大多数细胞在形态上更趋向巨噬细胞而不是DC，当IL-4加至1000 U/ml时，CD1a + 细胞为(21.8±0.32)%(组间比较，P<0.01)。
2 DC的形态与表型 在GM-CSF、TNF-α、FL、SCF的组合中，脐血CD34 + 细胞诱生的DC量最高，表型检测CD1a + 细胞占(27.18±1.56)%,CD80 + 细胞的比例为(42.28±3.16)%，HLA-DR表达占(93.7±1.0)%。培养至第8天，光镜下观察，细胞不贴壁，胞膜向外延伸出尖刺状突起。透射电镜下观察，DC的幔状突起更加清晰，胞浆内有大量线粒体聚集，内质网丰富，溶酶体及吞噬体不多。扫描电镜示DC的粗糙表面和层叠状的皱襞。
外周血的单核细胞在GM-CSF、IL-4诱生1周后即出现DC，较CD34 + 细胞来源DC体积小，电镜特点与前述差异不明显。两种来源的DC均在第8天时以流式细胞仪(FACS)分析其表型，结果显示了细胞因子组合、浓度与其表达量的关系：外周血单核细胞在IL-4为400U/ml时，产生的主要是巨噬细胞。CD1a + 细胞占(3.3±0.16)%，当IL-4用量达800～1000 U/ml时，DC才较多，CD1a + 、CD80 + 和HLA-DR+ 细胞的比例分别为(21.8±0.32)%、(50.2±3.12)%和(94.6±1.58)%。
3 DC的免疫刺激活性 DC刺激T细胞增殖反应时，当刺激细胞(外周血单核细胞-DC或脐血CD34 + 细胞-DC)与T细胞的比例为1∶10时，细胞3 H-TdR掺入量分别为(60.80±1.26)×103 /min和(48.20±1.41)×103 /min，两组比较差异无显著性;但两组分别与对照组[(7.20±1.16)×103 /min和(9.00±0.97)×103 /min]比较，P值均<0.01，差异有显著性，说明脐血CD34 + 细胞与外周血单核细胞诱生的DC均能激发同种异体T细胞的增殖，有较强的抗原递呈能力。
讨 论
细胞因子配伍及应用顺序在不同细胞来源DC的诱生中作用不同。我们在实验中发现，脐血CD34 + 细胞作为DC的一种来源，其细胞因子组合中除需要GM-CSF和TNF-α的支持外，SCF和FL也是有明确扩增协同效应的两种因子，SCF、FL存在的实验组中，其CD1a + 细胞比例由GM-CSF+TNF-α组的(4.12±0.6)%分别增至(12.3±0.33)%和(18.0±0.11)%(组间比较，P<0.01)。目前，认为FL的作用与CD34 + 细胞表达高水平的Flt3有关，两者结合可促进细胞的增殖。另外，FL可提高DC前体细胞的数量并延长其存活时间。由外周血的单核细胞诱生的DC，其产生量与表型的表达明显依赖于IL-4的加入量，且细胞形态也由巨噬细胞为主转向DC为主，这说明IL-4在早期加入可抑制单核细胞向巨噬细胞的分化。
在功能检测中，外周血单核细胞与脐血CD34 + 细胞诱生的DC与T细胞的比例为1∶10时，两种来源的DC差异无显著性，都有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力，能发挥较强的抗原递呈能力，均可作为诱生DC的理想来源。目前有学者认为，DC功能的发挥更多的是在病变部位或病原体与DC接触的微环境中，因此对这些DC进行深入探讨可能更有实际意义。
本课题受国家杰出青年科学基金(39825111)资助
参考文献
1 Steinman RM, Banchereau J. Dendritic cells and thecontrol of immunity. Nature, 1998 ,392:245-252.
2 Chapuls F, Rosenzwajg M, Yagello M, et al. Differentiation of human dendritic cellsfrom monocytes in vitro. Eur J Immunol, 1997, 27 :431-441.
3 Rosenzwaig M, Camus S , Guigon M, et al. The influence of interleukin (IL)-4,IL-13 andFlt3 ligand on human dendritic cell differentiation from cord blood CD34 + progenitor cells. Exp Hematol, 1998, 26:63-72.
4 Steinman R, Pack MV, Inaba K. Dendritic cells in the T-cell areas of lymphoid organs.Immunol Rev, 1997, 156:25-37.
5 裴雪涛，王立生，徐黎 ，等. CD34 + 造血祖细胞的定向诱导分化研究.中华血液学杂志，1998，19：289-293.
收稿：1999-01-25 修回：1999-05-31 , 百拇医药