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关键词：基因，p15；甲基化；聚合酶链反应；白血病，急性
【摘要 】 目的 探讨p15基因CpG岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测40例初治或复发急性白血病、5例完全缓解期白血病及8例(份)正常骨髓的p15基因CpG岛甲基化，并对MSP产物进行序列测定。结果 急性白血病患者p15基因CpG岛甲基化阳性率为80%，AML与ALL的阳性率(分别为83%和73%)差异无显著性；5例完全缓解期白血病患者中1例p15CpG岛甲基化阳性(该例患者不久白血病复发)；正常骨髓8例均为阴性，表明p15CpG岛甲基化为白血病细胞所特有；MSP产物测序结果与理论结果相符合，MSP敏感度可达10-3 。结论 p15CpG岛甲基化在各型急性白血病中均有很高的发生率，可以作为各型急性白血病通用的微量残留病(MRD)指标；白血病完全缓解期p15CpG岛甲基化仍为阳性可能预示着复发；MSP法DNA需要量极少，不需要有特异性酶切位点，无同位素污染，对标本要求不高，敏感度高，是甲基化研究的一个简便、敏感、特异的新手段。
Study on the methylation of p15gene CpG islands in acute leukemia: using methylation-specific PCR method
ZHANG Yusheng, LOU Fangding, YU Li.
Department of Hematology, General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract 】 Objective Toexplore the feasibility of the methylation of p15 gene CpG islands as a common gene markerfor all types of acute leukemias(AL). Methods The methylation of p15gene CpG islands in bone marrow from 40 cases of newly diagnosed or relapsed AL, 5 casesof AL in CR and 8 of normal subjects was analyzed by using methylation-specific PCR methods(MSP), and the product of MSP was sequenced. Results p15 geneCpG islands were methylated in 80% (32/40) of the newly diagnosed or relapsed AL， nodifference between AML and ALL was observed. One positive result was found in the 5 ALpatients in CR and this patient soon relapsed. The bone marrow cells from 8 normalsubjects did not have p15 gene CpG islands methylation, which suggested that suchmethylation was peculiar to AL cells. DNA sequencing confirmed the right expectedsequence. The sensitivity of MSP was 10-3 . Conclusion Themethylation of p15 gene CpG islands occurs very commonly in every types of AL. It can beused as a gene marker for ALs and for minimal residual disease in CR. MSP needs neitherspecial methylation-sensitive restricted sites, nor high volume of DNA. There is noradioactive pollution, and the sample need not be fresh. MSP is a very sensitive, simpleand specific method for the detection of DNA methylation.
【Key words 】 Gene,p15 Methylation Polymerase chain reaction Leukemia,acute
p15基因于1994年由Kamb发现，位于染色体9p21，其产物蛋白能抑制CDK(cyclin-dependent kinase)的活性，从而阻止细胞进入增殖周期，此功能与转化因子β(TGF-β)有直接联系[1] 。许多实验显示p15在白血病中表达失活，进一步研究发现其原因在于基因发生了CpG岛的异常甲基化，而并非基因的突变或缺失。我们采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)法，对不同类型的急性白血病p15异常甲基化进行了研究。
病例和方法
1 研究对象 初治或复发急性白血病共40例，均来自解放军总医院，男29例，女11例，年龄10～73岁，均符合FAB诊断和分型标准；其中急性髓系白血病(AML)24例，急性淋巴细胞白血病(ALL)15例，粒淋混合型1例。完全缓解期白血病5例，其中AML2例，ALL 3例。正常骨髓8例(份)，取自胸科非血液病手术患者肋骨。Raji细胞取自培养的对数生长期。
2 DNA提取 骨髓以肝素抗凝，经Ficoll液分选单个核细胞(MNC)后常规方法提取DNA[2] ；Raji细胞直接提取DNA。紫外分光光度计测定DNA含量，吸光度(A)260 /A280 ≥1.8。
3 PCR引物[3] 设计p15甲基化引物(p15M)及p15非甲基化引物(p15U)，两组引物由CybenSyn公司合成。其序列为：p15Msense:5′-CCCTTCGTATTTTGCGGTT-3′；p15M antisense:5′-CGTACAATAAACGAACGACCGA-3′，扩增产物148bp。p15U sense: 5′-TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT-3′；p15U antisense:5′-CCATACAATAACCAAACAACCAA-3′，扩增产物154bp。
4 MSP[3]
4.1 DNA的NaHSO3 处理：取DNA 2 μg溶于25 μl水中，加入0.4 mol/LNaOH 25 μl，37 ℃ 10分钟；再加入10 mmol/L C6 H6 O2 30 μl及3 mol/L NaHSO3 520 μl，液体石蜡覆盖(隔离空气)，在50 ℃16小时反应后冷冻除去液体石蜡，以Wizard DNA Clean-up System除盐；加入等体积0.6mol/L NaOH, 室温5分钟；再加入等体积6 mol/L NH4 Ac及二倍体积无水乙醇，-20℃过夜，12 000 r/min离心10分钟，得DNA沉淀，加入体积分数为70%的冷乙醇，12000 r/min离心10分钟×2次，弃上清，得DNA沉淀，吹干，30 μl去离子水溶DNA，-20℃保存或直接做PCR。
4.2 PCR：反应体系为40 μl，含1×缓冲液，MgCl2 6.7 mmol/L，引物1.5 pmol/L,dNTP (Promega公司) 1.25 mmol/L, NaHSO3 处理DNA约50 ng；96℃预变性5分钟，加入DNA聚合酶(Promega公司) 2.0 U。扩增条件：94 ℃ 45秒，60℃ 45秒，72 ℃ 45秒，35个循环，最后1个循环72 ℃延伸7分钟。
4.3 MSP产物电泳分析及测序：将MSP产物与上样液按6∶1混合，于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，于凝胶成像系统(UVP，美国)下检测、照相。配制30g/L的低熔点琼脂糖凝胶，将以p15M为引物的MSP产物与上样液6∶1混合后上样，电泳；以无菌刀片于紫外灯下切取阳性带，置于Eppendorf管中，加入等体积TE，60℃ 10分钟熔胶；加入1/10体积3 mol/L NaHAc,顺序以饱和酚、酚-氯仿(体积比为1∶1)、氯仿-异戊醇(体积比为25∶1)抽提，乙醇沉淀后得到MSP产物，电泳证实为所需片段，由中国科学院微生物研究所测定。
结果
1 各型急性白血病p15的MSP结果 40例初治或复发急性白血病患者MSP阳性率为80%(40例中32例阳性)，其中AML为83%(24例中20例阳性)，ALL为73%(15例中11例阳性)，两型间差异无显著性(P>0.05)，1例粒淋混合型患者为MSP阳性(图1)；5例完全缓解的患者有1例阳性(该例阳性者不久白血病复发，最终死亡)。
M:Marker;1:AML,幼稚细胞98%；2：ALL，幼稚细胞52%；
3：AML-CR；Mp：引物为p15M；Up:引物为p15U
图1 急性白血病的p15 MSP
2 细胞系及正常骨髓细胞的p15MSP结果 Raji细胞为阳性，8例(份)正常骨髓均阴性。
3 MSP敏感度测定 将Raji细胞的DNA以正常骨髓细胞的DNA稀释后再做MSP，结果显示MSP敏感度可达10-3 (图2)。
M：Marker;1～5：Raji细胞稀释至100 ～10-4 ；Mp：引物为p15M；Up：引物为p15U
图2 MSP敏感度测定
4 MSP产物测序结果 测以p15M为引物的MSP产物的一条链(相当于p15的antisense链)，结果显示，与p15原序列相比，G转化为A，而CG中G仍保持不变。
以p15M为引物之MSP产物部分序列与p15原序列的比较(划线及黑体示原序列中的G在MSP产物中转化为A)：
MSP产物序列：AA CGCGCCTA A TTTA CTTCTAAA AAAAAA C
p15原序列：GG CGCGCCTA G ATTG CTTCT
GGG AAAAAG C
MSP产物序列：GCCTAA CGCG A ACGCAA CCGAA CTCAAAA C
p15原序列：GCCTAG CGCG G ACG CAGCCG
AG CTCAAAG C
MSP产物序列：CGCTCTAA CC GCAAAA TACG A ACG
p15原序列：CGCTCTGG CC GCAGGG TGCG G ACG
讨 论
甲基化修饰是脊椎动物唯一的DNA自然修饰方式，在基因表达的调控、基因结构的稳定等方面有重要作用，与肿瘤的发生发展关系密切。白血病中的甲基化异常主要为某些基因(如p15、p16、ER、Hic1、Calc1等)的CpG岛发生甲基化，致使基因表达封闭，影响细胞的正常功能[4] 。Herman等[3] 在其他实验室研究的基础上总结出甲基化特异性PCR(MSP)方法，其原理为：双链DNA变性解链后，在HSO3 - 作用下发生C→U转化，C若已有甲基化则无此改变；甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上，因此在HSO3 - 作用后，DNACpG岛若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG，若有甲基化则为C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说，DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较，变化为C→T，CG→CG，相应其互补链的改变为G→A，CG→CG，本实验的测序结果与理论结果相符合，证实了实验的可靠性。
本实验中采用MSP法对不同类型的急性白血病的p15 CpG岛甲基化异常进行了研究，结果显示，80%(40例中32例)的初治或复发急性白血病患者均有p15的CpG岛甲基化，AML与ALL之间无显著差异。
本实验结果还表明，MSP的敏感度可达10-3 ；正常骨髓无p15的甲基化改变，说明这种甲基化异常是白血病肿瘤细胞所特有的，p15甲基化作为各型急性白血病通用微量残留病(MRD)指标，在特异性和敏感性上均比较理想。实验中检测5例完全缓解急性白血病患者的标本，其中有1例MSP阳性，后此患者白血病复发而死亡。这一结果说明p15甲基化作为急性白血病的MRD指标有一定的实用性。
MSP方法的建立为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。MSP与普通PCR的主要不同点在于对引物的设计有特殊要求，由于设计了甲基化引物M和非甲基化引物U，二者中至少有一个有扩增，否则即表明MSP失败，这样就无须设定内对照。此方法DNA需要量极少、不需要有特异性酶切位点、无同位素污染、敏感性高、对标本要求不高，陈旧标本，甚至蜡块均可使用。不过，由于MSP扩增产物中A及T比例非常高，与普通PCR相比，扩增条件需做适当的调整。近来Quesnel等[5] 又对MSP略加调整，但主要步骤未做改动。
综上所述，我们对急性白血病的p15 CpG岛甲基化进行了研究，结果显示：急性白血病p15CpG岛甲基化阳性率为80%(40例中有32例)，AML与ALL二型之间阳性率无显著差异，正常骨髓为阴性，表明p15CpG岛甲基化为白血病细胞所特有，白血病完全缓解期仍为阳性可能预示着复发(例数尚少，需要进一步观察)，p15甲基化可以作为各型急性白血病通用的MRD指标。本实验中采用MSP法，敏感度可达10-3 ，MSP产物测序进一步证实了实验的可靠性。
参考文献
1 Hannon GJ, Beach D. P15INK4B is a potential effector of TGF-β-induced cell cycle arrest. Nature, 1994, 371:257-261.
2 Maniatis T, Fritsch E, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 425-427.
3 Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation-special PCR: a novel PCR assay formethylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:9821-9826.
4 Issa JP, Baylin SB, Herman JG. DNA methylation changes in hematologic malignancies:biologic and clinical implications. Leukemia, 1997, 11 Suppl 1:s7-11.
5 Quesnel B, Guillerm G, Vereecque R, et al. Methylation of the p15 INK4b gene inmyeloidsplastic syndromes is frequent and acquired during disease progression. Blood,1998, 91:2985-2990.
收稿：1999-04-09 修回：1999-08-05
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