关键词：胃肿瘤；腺病毒；载体
【摘要】 目的 提高原位转基因效率，建立高效自杀基因杀伤胃癌肿瘤的方法。方法 首先构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组腺病毒载体并对载体进行包装、收获病毒上清及纯化。将重组病毒液直接转染至615小鼠皮下已接种MFC胃癌细胞成瘤的肿瘤部位进行抑瘤实验。结果 含CD基因的重组腺病毒载体经酶切鉴定正确；包装纯化后，检测病毒滴度为1.2×1012 颗粒/ml。将重组病毒液直接转染至肿瘤部位后，在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)作用下，肿瘤生长较对照组明显缩小(P<0.01)。病理学检查可见肿瘤细胞大片坏死，且未转基因部位亦存在坏死区。结论 腺病毒载体转导的CD基因，不仅提高了转染效率，而且可以大幅度杀伤肿瘤细胞以及产生强效的旁观者效应。
In situ anti-tumor effect resulting from cytosine deaminase gene delivered by adenovirus vector
CUI Long ，LIN Yanzhen ，JIN Guoxiang ，et al.
(Department of Surgery, Changhai Hospital of Shanghai Second Military Medical University, Shanghai 200433, China )
【Abstract 】 Objective To improve the efficacy of gene delivering and to search for an effective way to kill the gastric cancer cells by suicidal gene. Method Firstly, the adenovirus combinatant vector containing cytosine deaminase (CD) gene was cloned and the combinatant plasmid was packed, amplified and purified. The MFC were injected subcutaneously into the flank of 615 mice to establish tumor models, and when tumors were palpable, 0.2ml adenovirus combinatant liquid containing CD gene was directly injected into xenografts following administration of 5-FC for 35 days. Results The positive clones selected by using endonuclease to digest the combinatants and the concentration of viral liquids containing CD gene was 1.2×1012 particles/ml. Meaningfully, the antitumor effect was observed in tumors generated from MFC-CD(+) tumors when the animals were given 5-FC by intraperitoneal injection. Pathologically, the tumors generated from MFC -CD(+) cells had hemorrhagic necrosis in large scale within the tumor regions as compared with that of untreated animals with few necrotic areas. Conclusion The improved anti-tumor effect by adenovirus vector renders a basis for further research in gastric carcinoma involving the direct transduction of CD gene in tumors as well as induction of intensive bystander effect.
【Key words 】 Stomach neoplasms; Adenovirus; Vector
本研究在构建了含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组腺病毒载体，包装、收获及纯化病毒上清后，将上清直接转染到615小鼠前胃癌肿瘤中，系统给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC)，观察肿瘤的杀伤效应及引发的抗肿瘤免疫作用，为自杀基因对胃癌的治疗研究应用于临床实验奠定基础。
材料和方法
一、材料
含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCI(Promega)，重组逆转录病毒载体pCD2(美国MD Anderson癌症研究中心惠赠)[1] ，腺病毒载体pΔE1SP1A、pJM17(Microbix System公司)。凝胶层析柱PD-10(Pharmacia)，氯化铯(Sigma)。细胞株293(中科院上海细胞所)；小鼠前胃癌细胞株MFC(中国医学科学院基础医学研究所)。615小鼠(中国医学科学院肿瘤医院动物所)。
二、含CD基因的重组腺病毒载体的构建
以Bg1 Ⅱ、BamH Ⅰ限制内切酶酶切pCI和pΔE1SP1A质粒，回收来自pCI质粒的1.3kb插入片段和来自pΔE1SP1A的6.4kb载体片段。将两个片段以T4 连接酶进行连接。复用Bg1Ⅱ、BamH Ⅰ和Sal Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定含有连接成功的质粒，培养后碱裂解法大量制备质粒DNA，此质粒本实验室定名为AdpCI。
用Sal Ⅰ限制内切酶切开质粒AdpCI后，用Klenow酶和dCTP、dTTP将Sal Ⅰ切出的粘性末端进行部分补平。再用EcoR Ⅰ酶切出7.6kb的插入片段。同理用BamH Ⅰ酶切开质粒pCD2 ，用Klenow酶和dGTP、dATP将BamH Ⅰ切出的粘性末端进行部分补平。用EcoR Ⅰ酶切出1.5kb的载体片段。以上两个片段电泳、纯化、连接、抗性平板筛选阳性克隆，用EcoR Ⅰ单酶切和用BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定出具有成功连接的质粒，命名为AdCD。
三、重组腺病毒液的制备
293、MFC细胞均以DMEM,37°C，5% CO2 培养。于转染前24h，接种1×105 被转染细胞于6孔板内，第2天细胞60%～70%融合时开始以LIPOFECTAMINE转染。将超离纯化的AdCD与pJM17各2μg经脂质体转导，共转染至对数生长期的293细胞中进行同源重组，5h换DMEM培养液继续培养，以使重组腺病毒进一步复制，包装和感染，10d后原来贴壁细胞变圆、发亮和脱落，收集培养液上清及病理细胞，37°C～70°C反复冻融病理细胞3次，4 000r/min离心，收取细胞裂解粗提液。以适当稀释的病理293培养液上清或粗提液，在70%～80%融合度293细胞中大量扩增，收集培养液上清和细胞裂解非粗提液，采用氯化铯密度梯度两次离心法制备纯化的重组腺病毒颗粒。紫外分光光度计(波长260nm)比色适度稀释的纯化腺病毒悬液，根据A(吸光度)值计算Ad颗粒浓度(particles/ml)。公式：Ad颗粒浓度(颗粒数/ml)=A260 ×稀释倍数×1012 。
四、肿瘤模型的建立及原位转基因治疗研究
取6周龄615小鼠60只随机平均分成6组。将5×105 MFC细胞注射到小鼠左腿下，共接种50只，待肿瘤生长至直径为20mm时，将含CD基因的重组腺病毒0.2ml/只分别分3点注射到3组小鼠肿瘤内。将含1.7×105 CFU/L、含pCD2基因的重组逆转录病毒液1ml直接注射到1组小鼠肿瘤内。48h后转CD基因的肿瘤2组予以腹腔注射5-FC(剂量为500mg/kg体重)，1组予以腹腔注射生理盐水，1组不予处理，不转基因成瘤组及不成瘤组予以5-氟胞嘧啶(5-FC)治疗。共治疗35天。治疗结束后取下肿瘤标本，称重后制成病理切片，H-E染色后在显微镜下观察肿瘤病理学变化。采用配对计量资料的t检验进行统计学处理。
结果
一、载体构建及病毒滴度
AdCD重组腺病毒载体小片段最后经大量扩增后都经多酶切鉴定正确。经同源重组、纯化及比色法测定重组病毒滴度，含CD基因的腺病毒滴度为1.2×1012 颗粒/ml。
二、MFC肿瘤生长受抑情况
将5×105 MFC细胞注射到615小鼠左腿下，肿瘤生长无明显差异。经过5-FC治疗后，肿瘤重量：腺病毒转CD基因的肿瘤重量为(0.35±0.17)g，逆转录病毒转CD基因的肿瘤重量为(2.87±0.13)g，与腺病毒转CD基因组肿瘤生长差异有显著性(P<0.05,n＝10)；未转基因经5-FC治疗组、转基因经生理盐水治疗组、正常成瘤组及对照组肿瘤重量分别为(9.64±1.80)g、(10.57±2.06)g、(10.69±1.92)g及(9.15±0.83)g，与实验组差异有显著性(P<0.01,n=10)。
三、病理学改变
从病理切片中可见，在5-FC的治疗下，直接转CD基因的区域的肿瘤细胞呈现大片坏死，未转CD基因区域也可发现部分肿瘤细胞的坏死。而且，这些区域可见大量的炎性细胞浸润。对照组肿瘤未见明显异常。
讨论
一、关于重组腺病毒液的制备
重组腺病毒AdCD制备方法为细胞内质粒DNA同源重组法，即重组穿梭质粒AdCD的基因段腺病毒部分检测序列与35kb Ad大片段(JM17)环状质粒在293包装细胞内同源重组，同源序列发生同源重组后，形成0～100mu之间Ad重组病毒基因组DNA，并以二者LTR的复制和调控序列实现自身的复制；由293细胞提供反式互补E1蛋白，基因组自身包装信号实现自己的包装。形成复制缺陷型重组腺病毒以后，能引起293细胞毒性反应，表现为293细胞圆缩和悬浮的病理现象。重组病毒颗粒释放后，再去感染其它细胞，从而完成了293细胞原位的包装和扩增过程。
本实验用于重组腺病毒包装的小片段pΔE1SP1A及大片段pJM17为加拿大Microbix System公司提供，该质粒可以在细菌(DH52)内复制、繁殖，且纯化后可直接介导至293细胞内进行包装。
二、肿瘤内直接转基因问题
基因治疗最终要落实到临床应用，且基因治疗最有希望在无法切除或转移性实体瘤中发挥作用，这势必要求在术中予以直视下转基因，因此本研究即采用了原位转基因的肿瘤治疗模型。目前原位转基因方法有：裸DNA直接注射，病毒注射感染，脂质体包裹注射等，而病毒方法主要有逆转录病毒及腺病毒液直接注射法。我们在以前进行了一系列由逆转录病毒载体介导的自杀基因体外体内及肿瘤原位转基因实验研究[2-4] 逆转录病毒直接注射入肿瘤后，由于其病毒滴度低，感染的肿瘤细胞数目有限，因而就使自杀基因所发挥的作用范围偏小。而腺病毒的病毒滴度高，可达到1013 pfu/ml，其感染的肿瘤细胞远比逆转录病毒多，因而所转染的自杀基因所发挥的杀伤作用就远高于逆转录病毒转染方法。本实验以腺病毒液直接注射入肿瘤组织内进行感染，经治疗后肿瘤大幅度缩小比逆转录病毒感染的肿瘤缩小更快，病理改变比较明显。
三、体内肿瘤原位转自杀基因治疗的旁观者效应
自杀基因在转基因治疗后会产生强效的旁观者效应[5] 。现已发现，旁观者效应的作用已远非仅局限于转基因肿瘤局部区域，其可使在远处同时发生的未转基因肿瘤产生同步性杀伤效应[6] 。现在认为，有效的抗肿瘤免疫疗法必须具备两方面条件，一是激活抗肿瘤淋巴细胞，二是提供使前者能够浸润至肿瘤微环境内发挥杀伤作用的手段，即增加穿越肿瘤血瘤屏障及破坏肿瘤微环境的途径，以切实使抗肿瘤免疫作用发挥到实体瘤中。后者即可以由自杀基因导致的旁观者效应来完成。Freeman等在实验中还发现，在治疗开始后24h即发生了肿瘤的中心性出血坏死，因此他们检测了可以导致肿瘤坏死的因子TNF-α、白介素(IL)-12及IL-6等炎性细胞因子[7] 。结果在治疗24h内即可检测到TNF-α，IL-12及IL-6的表达，而对照组则全部为阴性，同时还分别在治疗48h检测到IFN-α，96h检测到GM-CSF的表达。TNF-α是已知的宿主抗肿瘤细胞，如巨噬细胞、NK细胞及细胞毒性淋巴细胞的激活因子，而IL-12不仅可以促进T淋巴细胞的增生，而且还可促使T细胞、单核细胞的粘附及增加内皮细胞的亲和性。激活的T细胞及巨噬细胞浸润到肿瘤内部可能直接导致了局部细胞因子的生成，进而T细胞引发了接踵而来的细胞因子(IFN-γ及GM-CSF)的分泌。前药/自杀基因系统的治疗导致了细胞因子的分泌，细胞因子又促使肿瘤内巨噬细胞和淋巴细胞的激活，这些激活的肿瘤浸润细胞，分泌细胞因子再产生进一步的抗肿瘤效应。
国家自然科学基金资助项目(39600142)
参考文献
[1]Mullen CA, Kilstrup M, Blaese RM. Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-flurocytosine: A negative selective system. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:33-37.
[2]崔龙，林言箴，朱正纲，等.5-FC/CD系统对荷大肠癌裸鼠肿瘤的杀伤效应.世界华人消化杂志，1999，7：473-475
[3]崔龙，林言箴，朱正纲，等.原位转导胞嘧啶脱氨酶自杀基因对大肠肿瘤的杀伤作用.中华消化杂志，1998，18：341-343.
[4]崔龙，程惠玉，林言箴，等.胞嘧啶脱氨酶基因对胃癌细胞的杀伤作用.中华实验外科杂志，1999，16：331-333.
[5]Freeman SM, Abond CN, Whatenby KA, et al. The “bystander effect”: tumor regression when a fraction of tumor mass is genetically modified. Cancer Res, 1993,53:5274-5283.
[6]Wei MX, Bougnoux P. Suicide gene therapy of chemically induced mammary tumor in rat: efficacy and distant bystander effect. Cancer Res, 1998,58:3529-3532.
[7]Ramesh R, Marrogi AJ, Munshi A, et al. In vivo analysis of the “bystander effect”: a cytokine cascade. Exp Hematol,1996:24:829-838.
(收稿日期： 1999-09-09 ) , http://www.100md.com