关键词：前列腺；去势；雄激素类；动物，实验
摘要 采用光镜、电镜、原位末端标记法，连续观察去势前后犬前列腺的病理学改变。去势后犬前列腺的病理改变可划分为新鲜凋亡期和陈旧凋亡期。去势不仅导致前列腺细胞的凋亡病变，还引起萎缩、坏死病变。此三种病变在前列腺上皮和基质内都存在，共同构成了去势晚期前列腺结构和功能的高度损害。
The morphological changes of canineprostate following castration NiuYuanjie,Dong Kequan, Bai Jingwen,et al.Tianjin Institute of Urological Surgery,Tianjin 300211
Abstract Light microscopy,transmission electron microscopy,and in situ celldeath detection were carried out successively before and after castration in canine.Theresult revealed that the process of the morphological changes following castration couldbe divided into two phases,the fresh apoptotic phase and the stale apoptotic phase.Notonly apoptosis but also atrophy and necrosis could be observed in prostatic tissue aftercastration.These three morphological changes were present on the prostatic stromal cellsjust as on the epithelial cells.The apoptosis,atrophy and necrosis in the epithelium andstroma caused serious injury to prostatic structure and function in the latter phase ofcastration.
Key words Prostate Castration Androgens Animals,laboratory
去势为研究雄激素在前列腺增殖与退化中的作用提供了良好的契机。本研究从去势前后犬前列腺动态病理学改变的角度，探讨在前列腺基质-上皮相互作用模式中雄激素的作用机制。
材料与方法
一、动物实验
将22只成年雄性家犬于去势前及去势后2、3、7、14、21、30、90天分别行前列腺活检术，留取犬前列腺组织标本。
二、光镜及电镜标本的制备
1.光镜标本的制备：标本取自前列腺侧叶，经10%甲醛溶液固定后，以石蜡包埋，切片厚度为5μm。HE染色后，在光镜下观察。
2.电镜标本的制备：同样的标本在2.5%戊二醛二甲胂酸钠溶液中固定后，以1%四氧化锇后固定，包埋于EPON 812内。切片厚度为60nm。用醋酸钠-柠檬酸铅染色后，在透射电镜下观察。
三、凋亡细胞的原位检测
采用德国宝灵曼公司的原位细胞凋亡检测试剂盒。前列腺组织切片上的凋亡细胞被染为蓝色。在光镜下计数每平方毫米凋亡细胞的百分数。阳性细胞数在5%以下为(-)；5%～(+)；10%～(++)；20%～(+++)；40%～(++++)。
结 果
一、光镜观察结果
去势后光镜下前列腺病理改变见表1，根据严重程度可将病变划分为三期：(1)轻度萎缩
表1 光镜下去势前后犬前列腺组织动态病理学改变
| 去势前 | 去势后 | ||||||||
| 2天 | 3天 | 7天 | 14天 | 21天 | 30天 | 90天 | |||
| 上 皮 细 胞 | 形态 | 高柱状 | 低柱状 | 低柱/ 立方 | 低柱/ 立方 | 立方/ 扁平 | 出现小 暗细胞 | 小暗/浓黑 染核细胞 | 大部分成浓 墨染核细胞 |
| 核改变 | 位于 基底 | 位于 基底 | 基底/ 中央 | 基底/ 中央 | 中央 | 浓染 变形 | 浓染变形 | 浓染变形 | |
| 分泌颗粒 | 多 | 减少 | 减少 | 少量 | 无 | 无 | 无 | 无 | |
| 胞浆幅 | 正常 | 无变化 | 无变化 | 变小 (红) | 变小 (红) | 极少且 淡染 | 极少且 见大空泡 | 极少 | |
| 上皮萎 缩程度 | 无 | 轻度 萎缩 | 轻度 | 轻度 | 中度 | 中/ 重度 | 重度 | 极度 | |
| 形态 | 扩张 | 增大/ 大囊状 | 无扩张 /变小 | 变小 | 明显 变小 | 有塌陷 实心管 | 部分保留 腺泡结构 | 罕见腺管， 条索状 | |
| 腺 泡 基 质 | 上皮内 折乳头 | 多 | 减少 | 减少 | 少量 | 无 | 无 | 无 | 无 |
| 分泌颗粒 | 多 | 减少 | 减少 | 少量 | 无 | 无 | 无 | 无 | |
| 腔内 分泌物 | 多 | 多 | 少 | 少 | 无 | 无 | 无 | 无 | |
| 与上皮 的比例 | 正常 | 正常 | 略增多 | 略增多 | 增多 | 增多 1/2 | 增多 | 比例明显 增加 | |
| 成分 | 正常 | 可见淋 巴细胞 浸润 | 无变化 | 无变化 | 纤维组 织萎缩 粘液变 性 | 同前 | 同前 | 胶原纤维稀 少，粘液变 性 | |
| 萎缩 程度 | 正常 | 轻度 | 平滑肌 萎缩， 核固缩 | 同前 | 同前 | 平滑肌 空泡变性 | 平滑肌萎缩 | 平滑肌高度 萎缩 | |
表2 去势后犬前列腺细胞凋亡，萎缩和变性坏死病变的比较
| 特征 | 凋亡 | 变性与坏死 | 萎缩 |
| 细胞形态 | 细胞高度皱缩，扭曲断裂 | 细胞肿胀，核浆，细胞 器膜破裂 | 扭曲皱缩 |
| 膜完整性 | 大部分保持到晚期，碎块 外有膜包绕 | 早期消失 | 保持到晚期 |
| 胞 浆 | 胞浆幅明显减小，呈分叶 状，阿米巴状，电子密度 致密而暗但较均匀 | 胞浆幅增大，有水肿及局部溶解 | 胞浆幅明显减少，电子密度致密而暗 |
| 核 | 染色质高度凝聚呈环形、半月形特征性核凋亡改变 | 核肿胀，染色质较粗，无环形，半月形凋亡凝聚带 | 核变小变暗，染色质呈块状或匀细。核受损晚 |
| 线粒体 | 存在，受损晚而病变轻 | 线粒体肿胀，膜、嵴溶解 | 线粒体萎缩变小而暗 |
| 溶酶体 | 无增加 | 增加，破裂溶解细胞器及核，形成次级溶酶体 | 大量增加，形成次级及终末溶酶体(脂褐素)，并充满胞浆 |
| 髓磷体 | + | +++～++++ | + |
| 病变出现的早晚 | 早期(2～3天即开始) | 多发生较早 | 多发生晚 |
期：在光镜下去势后7天以内，前列腺病变较轻。上皮细胞呈低柱或立方状，核位于基底或中央。腺泡形态基本正常。基质病变轻微。(2)中度萎缩期：介于轻度与重度萎缩期之间。上皮细胞呈扁平状。腺腔明显变小、塌陷。基质出现粘液变性。(3)重度萎缩期：在去势30天以后，光镜下可见大量典型的小暗细胞和浓墨染核细胞。小暗细胞的核近似淋巴细胞核，胞浆极少且淡染[1] 。
图1 去势3天，电镜下典型的分泌细胞凋亡，
核染色质凝聚成半月形
图2 去势7天，犬前列腺分泌细胞形成的凋亡小体呈高
电子密度，外形不规则，被临近的分泌细胞吞噬
二、电镜观察结果
去势后犬前列腺的超微病理改变，可划分为二期：
Ⅰ期(新鲜凋亡期)：为去势后7天以内。此期的特征是：(1)电镜下可见新鲜的凋亡细胞。表现为细胞皱缩，呈阿米巴状，伸出许多胞浆足，胞浆变暗。核染色质凝结成高电子密度物质，呈特征性的环形、半月形、帽形、三角形等典型改变。(2)上皮分泌细胞和基质细胞均发生凋亡。基质细胞病变程度轻于分泌细胞。(3)处于凋亡不同时期的细胞掺杂在一起。既可观察到新鲜的凋亡细胞，也可观察到凋亡小体及被邻近细胞吞噬的凋亡细胞(图1，2)。
Ⅱ期(陈旧凋亡期)：去势14天后，无论在上皮还是基质内均不见新鲜的凋亡细胞，但可见被邻近细胞吞噬的凋亡细胞、凋亡小体及残存的凋亡物质。凋亡小体的特征为：(1)较凋亡细胞小；(2)呈高电子密度；(3)凋亡小体外形不规则，扭曲，有突起；(4)可游离于细胞外，或被邻近细胞吞噬。
去势后，部分腺分泌细胞发生变性坏死病变，出现了核及胞浆溶解灶(图3，4)。此外，分泌细胞及基质细胞还出现萎缩病变(图5，6)。凋亡、萎缩和坏死三者的超微结构区别见表2。
三、原位细胞凋亡的检测结果(表3)
去势前后各期与细胞凋亡水平的关系见表3，经秩和检验，去势前后各期细胞凋亡水平有
图3 去势3天，早期坏死的犬前列腺分泌细胞。
胞浆水肿，内有不规则的溶解灶，线粒体嵴
少且暗，有初级溶酶体形成。核染色质较粗
图4 去势7天，坏死的犬前列腺上皮分泌细胞
图5 去势后30天，犬前列腺分泌细胞萎缩。核病变轻而细胞内充满终末溶酶体(脂褐素)
图6
去势30天，犬前列腺基质成纤维细胞萎缩表3 去势前后各期与细胞凋亡水平的关系
| 分级 | 去势前 | 去势后(d) | 合计 | ||||
| 3 | 7 | 14 | 30 | 90 | |||
| - | 16 | 16 | |||||
| + | 6 | 8 | 14 | ||||
| ++ | 10 | 1 | 2 | 3 | 2 | 18 | |
| +++ | 3 | 4 | 2 | 1 | 10 | ||
| ++++ | 1 | 3 | 1 | 5 | |||
| 合计 | 22 | 14 | 8 | 5 | 4 | 10 | 63 |
显著性差异(P<0.005)。进行两两比较的秩和检验，结果表明：(1)去势后各组的细胞凋亡水平均高于去势前(P<0.001)。(2)去势后7天细胞凋亡水平高于去势后3天，30天及90天的细胞凋亡水平。
原位细胞凋亡检测在去势后3天即可检出阳性结果，阳性细胞绝大部分是上皮分泌细胞。去势后7天时，阳性染色强度达高峰，且基质细胞也有阳性染色。随去势时间的延长，染色强度逐渐减弱。
讨 论
一、去势后前列腺细胞凋亡的分期
1972年，Kerr等[2] 首先观察到去势后鼠前列腺细胞具有特征性的病理改变，提出了细胞凋亡的病理学新概念，并将凋亡分为凋亡小体形成期和凋亡小体降解期。
1996年，Denmeade等[3] 将细胞凋亡的形态学改变与细胞生化改变结合起来，把去势后前列腺细胞的凋亡划分为D1 期(包括D1a 和D1b )，F期，D2 期(包括D2a 、D2b 、D2c )共6期。该分期方法精确地描述了单个细胞凋亡过程中细胞内基因表达及蛋白质功能改变与细胞形态学改变相对应的关系。
然而，本实验发现去势后犬前列腺细胞先后相继出现凋亡病变，处于凋亡不同时期的细胞掺杂在一起，不能用Denmeade方法准确分期。因此，依据光镜、电镜及原位细胞凋亡检测结果，将去势后犬前列腺细胞的凋亡过程分为新鲜凋亡期和陈旧凋亡期。在新鲜凋亡期，新的凋亡细胞不断出现，使凋亡细胞数逐渐增加。而在陈旧凋亡期，不再有新的凋亡细胞出现，凋亡物质被缓慢吸收。
二、去势后犬前列腺细胞出现凋亡、萎缩和变性坏死共存的病理学改变
凋亡、萎缩和变性坏死病变具有不同的形态学表现，其根本原因是各病变的生化改变截然不同。凋亡是细胞受内外信号刺激后，在某些凋亡基因调控下而产生的主动的自杀现象。其生化基础是包括内源性核酸内切酶等多种酶类的活化。坏死则是细胞溶酶体破裂后产生的细胞溶解过程，可能与自由基损伤，ATP排空及热休克蛋白和泛醌的合成有关。萎缩病变则与细胞内酶类表达的缺失有关。
去势后犬前列腺细胞凋亡出现早而较集中，凋亡物质吸收慢。萎缩病变出现晚且以基质细胞更显著。变性坏死改变出现较早而消失快。此三种病变相互交织，逐渐加重，共同造成了去势晚期前列腺结构和功能的高度退化。多种病变共存的原因可能是：(1)前列腺内不同类型，不同分化阶段的细胞对雄激素的依赖程度不同。(2)去势可诱发处于细胞周期不同阶段的细胞进入不同的退化途径。
三、去势后犬前列腺上皮分泌细胞和基质细胞均有不同程度的凋亡，萎缩和坏死病变
去势后前列腺上皮分泌细胞的凋亡病变最为显著，形态典型，病变程度重。而前列腺基质细胞以萎缩病变为主，萎缩病变典型。此外，基质内还可以观察胶原纤维的粘液变性。
四、雄激素在前列腺增殖与退化中的作用
本实验结果表明：前列腺作为睾丸雄激素的靶器官，其上皮和基质均对雄激素表现出不同程度的依赖性。文献资料显示：雄激素主要作用于前列腺的基质细胞，调节基质细胞分泌多种生长因子(EGF、IGFs、TGFs、FGFs)，这些生长因子既作用于上皮细胞(旁分泌作用)，又作用于基质细胞(自分泌作用)，调节上皮和基质的增殖状态。在基质-上皮相互作用模式中，雄激素起着调节基质和上皮平衡的作用[4～7] 。
去势后，犬血清及前列腺组织内的雄激素水平急剧下降[3] 。由于失去了雄激素的作用，前列腺基质细胞不能正常分泌生长因子。前列腺上皮细胞在失去存活依赖性的生长因子后，发生凋亡病变。同时基质细胞也因失去了生长因子的自分泌作用而萎缩、凋亡。基质细胞数目的减少和功能障碍又加重了生长因子的缺乏，使去势后前列腺病变进入了恶性循环。
本课题受天津市自然科学基金资助
参 考 文 献
1 JamesO'D McGeel.In:McGeel JO,eds.Oxford Textbook of pathology.Vol 1.1st ed.Oxford:Oxforduniversity press.1992,154-163.
2 Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:A basisbiological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br JCancer,1972,26∶239-257.
3 Denmeade SR,Lin XS,Issacs JT.Role of programmed(apoptotic) cell death during the progression and therapy for prostatecancer.Prostate,1996,28∶251-265.
4 Lee C.Role of androgen in prostate growth and regression:stromal-epithelial interaction.Prostate,1996,28，(suppl 6)∶52.
5 Lee C,Kozlowski JM, Grayhach JT.Etiology of benignprostatic hyperplasia.Urol Clin North Am,1995,22∶237-246.
6 牛远杰，董克权，马腾骧.良性前列腺增生症的间质-上皮相互作用机制.中华泌尿外科杂志，1996，17∶379-382.
7 BymeRL.Peptide growth factors in the prostate as mediators of stromal-epithelialinteraction.Br J Urol,1996,77∶627-633
(收稿：1997-07-23 修回：1997-12-15)
, 百拇医药