关键词：肝肿瘤 癌，肝细胞 粘附 细胞周期 微管吸吮
摘要 目的研究大鼠肝实质细胞癌细胞(HTC)与不同浓度胶原蛋白Ⅳ裱衬的人工基底膜的粘附特性和G1 、S期HTC细胞与一定浓度胶原蛋白Ⅳ裱衬的人工基底膜的粘附特性。方法 同步化G1 和S期细胞以胸腺嘧啶核苷和秋水仙碱顺序阻断法及胸腺嘧啶核苷双阻断法分别获得，细胞与人工基底膜的粘附特性采用微管吸吮技术测定。结果以胸腺嘧啶核苷和秋水仙碱顺序阻断法及胸腺嘧啶核苷双阻断法可分别获得72.10%的G1 期和98.94%的S期HTC细胞，HTC细胞与胶原蛋白Ⅳ裱衬的人工基底膜的粘附力跟胶原蛋白Ⅳ的浓度成正相关关系，各组之间差异有显著性；G1 期HTC细胞的粘附力比S期显著要大。结论肿瘤早期基底膜含量的增加可能有利于肿瘤细胞的趋化运动和粘附；G1 期肿瘤细胞的粘附力比S期显著要大，提示其细胞表面粘附分子受体分布的周期性差异以及G1 期肿瘤细胞更易于粘附并穿透基底膜的可能。
Investigation on theadhesive properties of different cycle hepatoma cells
YU Weiqun, SONG Guanbin, LONG Mian, et al.
Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400044
Abstract Objective To study the adhesiveforces of HTC cells on different concentration of artificial basement membrane (collagenⅣ coated)and synchronous G1&S phase HTC cells on a certain concentration ofartificial basement membrane. Methods The adhesive forces of HTC cells were investigatedby micropipette aspiration technique. The synchronous G1 and S phase cells wereachieved through thymine-2-desoryriboside and cochicine sequential blockage method anddouble thymine-2-desoryriboside blockage method respectively. Results HTC cells with72.10% of G1 phase and 98.94% of S phase were achieved throughthymine-2-desoryriboside and cochicine sequential blockage method and doublethymine-2-desoryriboside blockage method respectively. The adhesive force of HTC cells onartificial basement membrane was in direct proportion to the concentration of collagen Ⅳ.G1 phase HTC cells had higher adhesive forces than S phase cells. ConclusionThese studies suggested that the increase of basement membrane might be conducive to thechemotactic motion and adhesion of tumor cells; G1 phase cells were morecapable of adhering to and getting through basement membrane than S phase cells, andreflected the differences of receptors between G1 phase cells and S phasecells.
Key words Liver neoplasms Carcinoma, hepatocellular Adhesion Cell cycleMicropipette aspiration
对于肿瘤细胞与基底膜粘附的研究，较为常用的方法是计算细胞粘附百分比、细胞脱落率等，该方法提示的只是一种细胞的群体效应，也不能予以很好的定量，并且肿瘤细胞常处于粘附与去粘附的活跃状态。对于分细胞周期细胞粘附特性的研究则报道不多。我们拟用微管吸吮技术(Micropipetteaspiration technique)对肿瘤细胞与基底膜的粘附特性进行一些探索。
材料与方法
一、 材料
大鼠肝实质细胞癌细胞(HTC)由重庆医科大学临床生化教研室赠送，在本实验室以RPMI—1640+20%小牛血清(Gibco公司产品)传代培养。主要考察不同浓度(1
g/ml，2g/ml，5g/ml)鼠胶原蛋白Ⅳ(Sigma公司产品)裱衬人工基底膜表面细胞粘附性的差别和不同周期细胞(G1 、S)在一定浓度(5g/ml)胶原蛋白Ⅳ裱衬人工基底膜表面粘附特性。
二、 方法(一)同步化细胞制备及同步率检测：
1.G1 期细胞同步化采取以胸腺嘧啶核苷和秋水仙碱顺序阻断后释放的方法，其简要步骤如下：取处于对数生长期的细胞加入胸腺嘧啶核苷至其终浓度为2mmol/L，37℃，5%CO2 潮湿空气中培养15小时，弃去培养液，以Hank’s液清洗细胞后加入新鲜培养液及秋水仙碱至其终浓度为1g/ml，同上培养12小时，横向轻轻摇动培养瓶收集M期细胞，于离心管中800r/min离心3分钟，弃上清，然后加入新鲜培养液及血清常规培养，3小时后以0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶消化收集，其中部分细胞用于同步率检测，部分细胞用于粘附性实验。
2.S期细胞同步化采取以胸腺嘧啶核苷双阻断法，简要步骤如下：取处于对数生长期的细胞加入胸腺嘧啶核苷至其终浓度为2mmol/L，培养15小时，弃去培养液，以Hank’s液洗涤细胞后加入新鲜培养液培养10小时，再次加入胸腺嘧啶核苷至其终浓度为2mmol/L，培养15小时，弃去培养液，以Hank’s液清洗细胞后加入新鲜培养液培养2小时后以0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶消化收集，其中部分细胞用于同步率检测，部分细胞用于粘附性实验。
3.同步率检测：将收集样本以PBS清洗，碘化丙啶(PI)染色30分钟，流式细胞仪检测，进行细胞周期分析。
(二)Chamber底面裱衬：取消毒好的Chamber一个，吸取400l 2g/ml的多聚赖氨酸(PDL，Sigma公司产品)溶液均匀铺满整个Chamber底面，37℃水浴40分钟，然后从Chamber边缘吸去溶液，轻轻加入PBS液400l洗去未吸附之多聚赖氨酸共两次，接着加入胶原蛋白Ⅳ溶液400l，均匀铺满整个Chamber底面，37℃水浴40分钟后吸去溶液，重复上述清洗过程后备用。
(三)粘附性测定技术：采用微管吸吮技术对细胞的粘附特性进行实验测试，简要方法如下：(1)制备约1×105 个/ml的单细胞悬液，悬液中含10%小牛血清；(2)将显微操作系统、实验记录系统及压力控制系统等(参见吴泽志等[1] 的方法)调试好备用；(3)吸取400～500l细胞悬液加入裱衬好的Chamber中，置于显微镜37℃恒温载物台温育20分钟；(4)在显微操作视野下将微管(初压为零)轻轻靠近细胞，然后给以一定负压吸住细胞并匀速轻轻右拉，倘该负压不足以拉脱细胞，则调高负压后重试，直到刚好拉脱(临界粘附力值)为止，并同时进行实验记录。
(四)实验数据处理
1.实验所测细胞粘附力(F)计算公式为：F=
R2. △P. Cos
，其中R为微管内半径(在图像处理系统上测出，本实验微管内半径在2.5～3.5m之间)，△P为吸吮负压，为微管与平面夹角，约10°左右，这样Cos=Cos10°≈0.985≈1，因此数据处理时直接以1计算，则F=R2. △P。
2.实验所测细胞各组粘附力值进行两样本均值的t检验。
结 果
一、 细胞周期同步化用流式细胞仪测定同步化于G1 期和S期的HTC细胞，其同步率分别为72.10%和98.94%，并能稳定维持这一水平。
二、 HTC细胞在不同浓度胶原蛋白Ⅳ裱衬人工基底膜表面的粘附力值，见表1。
表1 HTC细胞在不同浓度人工基底膜裱衬表面的粘附力
| Ⅳ胶原 | F(10-10 N) |
| 1mg/l(n=73) | 107.78±65.44 |
| 2mg/l(n=91) | 182.60±107.88* |
| 5mg/l(n=87) | 298.91±144.13+ |
g/ml比较，P<0.001；+ 与CollagenⅣ2mg/ml比较，P<0.001；n为所测细胞个数，下同。 三、 G1 期(n＝77)和S期(n＝100)细胞在5g/ml胶原蛋白Ⅳ裱衬人工基底膜表面的粘附力值分别为(275.86±232.80)×10-10 和(161.16±120.40)×10-10 N，差异有显著性(P<0.001)。
讨 论
肿瘤细胞与基底膜的作用，一般认为是：首先肿瘤细胞粘附于基底膜成份胶原蛋白Ⅳ和层粘连蛋白等，然后释放水解酶破坏基底膜，最后是游走穿过基底膜。在此过程中，整合蛋白分子及其基底膜的配体起着调节粘附与去粘附的重要作用。
HTC细胞与胶原蛋白Ⅳ裱衬的人工基底膜的粘附力与胶原蛋白Ⅳ浓度密切有关，各浓度组之间差异有显著性，与王宪航等[2] 的报道一致。王芳等[3] 发现随着肿瘤的生长，基底膜胶原蛋白Ⅳ和层粘蛋白等的含量均增加，但随着肿瘤的转移又出现基底膜减少甚至缺损的现象。所以，其不同的浓度可能反映了肿瘤细胞与其不同的相互作用，其浓度的增加在肿瘤细胞穿透基底膜前可能起着重要作用，使肿瘤细胞产生趋化性，并定向活跃运动，同时提供较强的粘附力和粘着位点。
G1 期HTC细胞的粘附力显著比S期的要大，并且标准差也特别大。一般来说转移性肿瘤细胞纤维粘连蛋白受体表达下降而层粘连蛋白受体增加。Liotta等[4] 认为侵袭性的人乳腺癌细胞膜具有比良性乳腺损伤的细胞膜大50倍的层粘连蛋白结合能力。纤维粘连蛋白在改善肿瘤细胞的铺展及促进S/G2 期DNA的合成和增殖方面发挥较大作用，而层粘连蛋白则对肿瘤细胞的粘附及运动游走所起作用更大[3] ，Terranora等[5] 认为肿瘤转移主要通过层粘连蛋白对胶原蛋白Ⅳ具有强的粘附力，而从细胞周期角度讲，M期细胞表达的纤维粘连蛋白受体是最少的，因此G1 期和S期粘附力的差异可能就反映了其表面粘附分子受体，尤其是纤维粘连蛋白和层粘连蛋白受体分布的周期性差异。另外，层粘连蛋白与纤维蛋白溶酶具有很强的亲和性，二者结合后可使纤维蛋白溶酶原活化成纤维蛋白酶水解层粘连蛋白和纤维粘连蛋白，及活化前胶原酶，从而降解基底膜，G1 期细胞的高粘附力值及大标准差的现象，也可能与此有关，从而使G1 期细胞表现出粘附与去粘附的活跃状态，反映出在肿瘤的侵袭和转移过程中，G1 期细胞比S期细胞可能更易于粘附并穿透基底膜。
基金项目: 本课题受国家自然科学基金资助(基金编号39500037)
参考文献
1 吴泽志，邵开峰，宋关斌，等.肝癌细胞在Ⅳ型胶原裱衬表面的粘附特性. 中华医学杂志，1999, 79:1-4.
2 王宪航，龙勉，王晓军，等.肝癌细胞与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面粘附特性. 生物物理学报，1996, 12:686-690.
3 王芳，高进.恶性肿瘤体内外生长和发展过程与细胞外基质相关性的研究.中华肿瘤杂志，1998, 20: 112-115.
4 Liotta LA, Rao CN, Barsky H. Tumor invasion and the extracellular matrix. Lab Invest,1983, 49: 636-649.
5 Terranora VP, Liotta LA, Russo RG, et al. Role of laminin in the attachment andmetastasis of murine tumor cells. Cancer Res, 1982, 42: 2265-2269.
本文编辑：袁平戈 校对：何亚玲
收稿：1998-12-02
修回：1999-05-26 , http://www.100md.com