关键词：噬菌体 抗体 乙肝表面抗原 抗体亲和力 链替换
摘要 目的 通过轻链替换，提高抗HBsAg噬菌体抗体的结合力。方法 将PCR扩增的人抗体轻链基因，插至已克隆有人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体重链Fd基因的噬菌粒中，构建成轻链替换文库，通过亲和淘洗，筛选与Fd相匹配的轻链基因。结果 经亲和淘洗后，筛选出了与Fd相匹配的轻链基因，链替换后，噬菌体抗体(PhAb)的ELISA光吸收值(A)从0.43±0.09提高到最高为1.24±0.10。抑制实验证实所筛选出来的phab具有抗HBsAg的特异性。分析了ELISA光吸收值(A)最高的5株噬菌体抗体的轻链基因序列，结果表明，3株k链的碱基序列一致，属VkⅢ亚群；2株λ链的基因序列相同，均属VλⅠ亚群。结论 结果表明经链替换的噬菌体抗体结合力了较大提高，并具有与HBsAg结合的特异性。
Improvment in affinity of phageantibodies against HBsAg by light chain shuffling
MAO Chunsheng,SONG Hongbin,LI Jizhi,etal.
Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850
Abstract Objective Wehad cloned an Fd gene of human antibody against HBsAg previously.The objecitve of thisexperiment is to improve the affinity phage antibody by chain-shuffling.Methods Human antibody light chain gene repertoire was generated by RT-PCR from human peripheralblood lymphocyte,and then phage antibody sublibrary was constructed by inserting therepertoire into the phagmid which contained the Fd gene.The matched gene of light chainwas selected by biopaning.Results After three rounds of selection,eightclones with higher absorbance than that of original clone at 490 nm in ELISA wereobtained.DNA sequencing showed three of the five VL genes were k type,and the other twowere l type.Conclusion The results indicated that the affinity of chainshuffled phage antibodies(phab) were improved.The specificity of the selected phab wasalso confirmed.
Key words Phage Antibody HBsAg Antibody avidity Chain shuffling
我们从抗体组合文库中筛出了抗HBsAg的噬菌体抗体[1] ，但该PhAb仅含有重链Fd段基因，而无轻链基因，亲和力不高。本实验采用链替换的技术和方法，从抗体轻链替换文库中筛选出了与之相匹配的轻链基因，提高了人源抗HBsAg噬菌体抗体结合力。
材料与方法
1 .mRNA的来源和轻链基因PCR扩增：从3名志愿者抽取外周血各100ml，分离淋巴细胞，提取mRNA(美国Invitrogen的mRNA提取试剂盒)。接着以oligo-d(T)为引物，用第一条链合成试剂盒(美国GibcoBR-L)反转录为cDNA，然后分别扩增免疫球蛋白的k和l轻链基因。PCR扩增条件是：变性94℃40秒，退火52℃ 40秒，延伸72℃ 1分钟，35个循环，所有引物6条共对按文献[2]报道的序列合成。
2 .链替换：含有重链Fd区基因的噬菌体(简称H3株)为本所筛选[1] 。链替换实验参照Ohlin等[3] 报道的方法进行。
3 .细菌电转化：宿主菌为E.coli XL1-Blue，仪器为Bio-Rad公司的基因脉冲仪，电转化条件是25mF，2.5 kV和200Ω
4 .亲和选择：ELISA板条用100 ml鼠抗HBs抗体的碳酸盐(pH8.6)在4℃下包被过夜。牛血清白蛋白封闭，PBS/T(0.1mol/L PBS,0.1% Tween-20)洗3次。然后，用含有HBsAg(2mg/ml)的PBS/T在4℃下孵育过夜。以后亲和选择的淘洗过程按文献[4]介绍的方法，共进行3轮。
5 .亲和选择后筛选：第3轮亲和选择洗脱下来的噬菌体，感染的XL1-Blue后划板。随机挑取所长出来的菌落，于2ml SB(含有10 mg/ml四环素、50 mg/ml羧苄青霉素)中37℃培养4小时左右(此时A600 =0.7-1.0)，加入50ml辅助噬菌体VCSM13(每升1012空斑形成单位),37℃培养过夜。1 000×g离心10分钟，取上清滴定噬菌体的菌落形成单位(cfu)，并调整至1.3×1010 cfu/ml，然后取25 ml，与等体积的PBS/T混匀加到包被的ELISA板孔内，37℃2小时。用PBS/T洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗噬菌体VCSM13的抗体(本室制备)，37℃1小时。用PBS/T洗3次、显色。实验中以辅助噬菌体VCSM13为阴性对照。
6 .抑制实验：筛选出的阳性克隆的噬菌体25 ml，与25ml用PBS/T稀释的含量为10 mg/ml的HBsAg、HBcAg或HCV核心抗原混匀，加至已包被HBsAg的ELISA板孔内，以未加HBsAg的噬菌体(25ml噬菌体和25 ml PBS/T)为对照，孵育和显色方法同上。在酶联读数仪(490nm)上读取结果并计算抑制率，抑制百分率=100-100×(加HBsAg后的A值)/(未加HBsAg的A值)。
7 .DNA序列测定：将轻链用SacⅠ和XbaⅠ从噬菌粒上切出来，与相应酶切的pBluescriptSK(+)连接，提取阳性菌落的质粒，用美国Life Science公司的SequenaseVersion 2.0 DNA试剂盒，以35 S-dATP(美国Dupon公司)进行标记，按操作步骤进行DNA序列测定。
结果
1 .轻链文库的构建与亲和筛选择：从构建成噬菌体轻链替换文库中随机选取10个克隆并提取其质粒，用XbaⅠ和SacⅠ酶切来鉴定轻链插入情况，发现轻链的插入率70%(7/10)。
2 .阳性克隆的筛选和竞争抑制实验：从第3次亲和选择洗脱下来的噬菌体感染细菌所长出来的菌落中挑选出35个，进行ELISA检测，A值高于H3株噬菌体抗体的克隆有8个。7个克隆中，有5个可被HBsAg抑制，抑制率为38.8%～75.0%，但均不能被HBcAg和HCV核心抗原所抑制，说明所筛选出来的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体。
3 .序列分析：对被HBsAg抑制的5个噬菌体克隆，进行了抗体基因的序列测定，其中重链与以前测定的H3株[3] 相同，证明在链替换过程中重链Fd区的基因既未终丢失也未突变。
5株PhAb的轻链基因，3株属k链，为VkⅢ亚群，碱基序列基本一致，如图1；另2株属λ链，为VlⅠ亚群，碱基序列相同，如图2，这两个序列已为国际基因数据库GenBank所收录。同时发现，8号和20号克隆的碱基序列同源性很高，但二者的5'端引物区序列不同，8号的3'端引物区序列为VK1，20号为VK2。
GAGCTCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGA AACAGCCACC 60
CTCTCCTGCA GGACCAGTCA GAGTATTAGC AGCAAC TACT TAGCCTGGTT CCAGCAGAAA 120
CDR1
CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATGTTT GCTACATCCT ACATGACCTC T GACTTCCCA 180
CDR2
GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGCAG 240
CCTGAAGATG TTGCAGTGTA TTATTGTCAG CAGTATGGTT ACTCACCGTG GACGT TCGGC 300
CDR3
CAAGGGACCA AGGTGGAAAT CAAACGAACT 360
图1 #8噬菌体轻链可变可区(KP8)的碱基序列
(GenBank登录号：AF051100)
GAGCTCGTGG TGACTCAGCC ACCCTCAGCG TCTGGGACCCCCGGGCAGAG GGTCACCATC 60
CCTTGTACTG GAAGCAGCTC CAATATCGGG ACTAATACTG TAAAC TGGTA TCGTCAAGTC 120
CDR1
CCAGGCGCGG CCCCCACACT TCTCCTCTAC AGTAATATTC ATCGGCCCTT A GGAGTCCCT 180
CDR2
GACCGTTTCT CTGGCTCCAA GTCTGGCTCT TCAGCCTCCC TGGCCATCAG CGGGCTTCAG 240
TCTGAAGATG AGGCGCCTTA TTACGTGCAG CGTTGGGATG ACAGCCTGCA TGCTAGTT TC 300
CDR3
GGAAGCGGGA CCAAGGTCGG AGTTCCGAGT AGTCAGCCCA AGG 360
图2 #25噬菌体抗体轻链可变区(LM25)的碱基序列
(Genbank登录号：AF051809)
讨论
从噬菌体抗体文库中筛选，只有当库容量很大(>1010 )时，才可能直接得到高亲和力的抗体基因。而天然文库、半合成文库或免疫文库的库容量一般在107 ～108 之间，从这些文库中筛选出来的抗体，亲和力一般较低，不能满足临床治疗的需要。高亲和力的获得，需象体内一样，要经过亲和力成熟[3] 。体外亲和力成熟的技术和方法以链替换法应用最广泛。本实验将PCR扩增的人抗体轻链基因，插至已克隆有人源抗乙型肝炎表面抗原抗体重链Fd基因的噬菌粒中，构建成次级抗体文库，经亲和淘洗，从该文库中筛选出了与重链Fd基因相匹配的轻链基因。
抗体的亲和力应以抗原抗体反应以解离常数(Kd)来表示，ELISA的光吸收值(A)仅代表抗体的结合力。本实验由于是比较各株噬菌体抗体的亲和力差别，而ELISA的其它实验条件包括抗体的用量(每孔均为3.2×108 cfu)相同，故A值的大小，可代表亲和力的高低。ELISA的A值由0.43±0.09提高到链替换后的1.24±0.10，说明链替换后噬菌体抗体的结合力得到了较大提高。
高亲和力抗体基因的克隆为人源基因工程的抗体生产基础，我们克隆基因为抗HBsAg抗人源体的制备迈出了关键的一步。
本课题受国家863计划重大项目资助，编号Z18-01
作者简介：毛春生，男，35岁，博士，发表论文20余篇。
参考文献
[1]宋宏彬，毛春生，王学，等.人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及重链基因的结构分析.第四军医大学学报，1998,19:481-483.
[2]Bachelder R,Bilancieri J,Lin WY,et al.A human recom-binant Fab identifies a humanimmunodeficiency virus type 1-induced conformational change in cell surface-expressedCD4.J Virol,1995,69: 5734-5742.
[3]Ohlin M,Owman H,Mach M,et al.Light chain shuffling of high affinity antibody resultsin a drift in epitope recognition.Mol Immunol,1996,33: 47-56.
[4]Barbas CF Ⅲ,Lerner RA.Combinatorial immunoglobin libraries on the surface of phage(phabs): rapid selection of antigen-specific Fabs.Methods: Companion MothodsEnzymol,1991,2: 119-124.
(本文编辑：袁平戈 校对：金生)
(收稿：1998-03-01 修回：1998-10-20) , 百拇医药