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关键词：乙型肝炎 淋巴细胞 凋亡
【摘要 】目的 探讨乙型肝炎患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes, PBL)凋亡在乙型肝炎病毒(HBV)持续感染中的作用。方法 分离15例慢性乙型肝炎患者PBL，体外单独或与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)或重组HBcAg(rHBcAg)共培养，用荧光素YOPRO-1和Hoechst33342对PBL染色，观察PBL中凋亡细胞比例。结果 慢性乙型肝炎患者PBL体外培养48小时后，无论自发性还是由SEB或rHBcAg诱导的PBL凋亡率均明显高于正常对照组，P<0.01。其中rHBcAg诱导的PBL凋亡率最高，达24.6%。血清HBeAg阳性组患者PBL凋亡率明显高于HBeAg阴性组患者。慢性轻度和中度肝炎PBL凋亡率又高于慢性重度或慢性重型肝炎患者。结论 慢性乙型肝炎PBL凋亡可能是HBV持续感染的重要因素之一。
Apoptosis of peripheral blood lymphocytes of patients with chronic hepatitis B and clinical significance
JI Wei, WANG Huifen, FENG Chuanqian, et al.
302 Hospital of PLA, Beijing 100039
【Abstract 】 Objective To explore the effects of apoptosis of peripheral blood lymphocytes (PBLs) of patients with chronic hepatitis B (CHB) on the persistent infection of hepatitis B virus (HBV). Methods The PBLs of 15 patients with CHB were isolated and cultured with or without Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB; 0.2mg/L), or in the presence or absence of recombinant HBcAg (rHBcAg; 1.0mg/L) for 48 hours in vitro. After incubations, the cells were harvested by centrifugation and then apoptosis of the PBLs was studied by staining with fluorescent dyes YOPRO-1 and Hoechst33342. Results The percentage of apoptotic cells of PBLs of patients with CHB was significanlty higher than in normal controls (P<0.01) in the presence or absence of SEB or rHBcAg, but the ratio of apoptotic cells in rHBcAg-stimulated PBLs of the patients was the highest, reaching (24.6±6.1)%. The patients with seropositive for HBeAg had higher percentage of apoptotic cells in their cultured PBLs than those with seronegative for HBeAg had, but the ratio of apoptotic cells in cultured PBLs of the patients with chronic heavy and severe hepatitis B was lower than that of the patients with chronic mild and moderate hepatitis B (P<0.01). Conclusion Activation-induced cell death of PBLs of the patients with CHB may be related to persistent infection of HBV, and assay of apoptosis of PBLs of patients with CHB may provide valuable information about pathogenesis of CHB.
【Key words 】 Hepatitis B Lymphocytes Apoptosis
乙型肝炎病毒(HBV)持续感染及致病机理尚未完全清楚。免疫细胞凋亡可能是HBV在感染者体内持续存在重要因素之一。我们研究慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes, PBL)凋亡的变化，探讨免疫细胞凋亡在HBV持续感染中的作用。
资料与方法
1.研究对象：15例住院男性慢性乙型肝炎患者均符合1995年第6次全国病毒性肝炎会议的诊断标准。年龄16～45岁，平均32.9岁。慢性肝炎轻度6例，慢性肝炎中度2例，慢性肝炎重度2例，慢性重型肝炎5例。其中5例经病理证实为慢性肝炎轻度或中度。血清HBV DNA阳性患者10例，阴性5例；血清HBeAg阳性患者9例，阴性6例。6例健康人为正常对照组。
2.分离外周血淋巴细胞：抽取肝素抗凝全血10ml，用淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液病研究所产品)分离PBL,经2%台盼蓝染色证实活细胞在95%以上。
3.细胞培养：将PBL分成空白组、重组HBcAg(r-HBcAg,1.0mg/L, 由戎广亚博士和程云博士馈赠)处理组和金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB 0.2mg/L, 美国Sigma公司)处理组。细胞培养于24孔板内，在37℃、体积分数5%CO2 条件下培养。培养液为含体积分数10%的灭活胎牛血清(美国GIBCO公司)、2mmol/L谷氨酰胺(美国Sigma公司)及青霉素和链霉素各100U/ml的RPMI 1640(美国GIBCO公司)。每孔细胞约1×106个。细胞培养48小时进行细胞凋亡检测。
4.检测凋亡细胞：生理盐水洗涤细胞两次，500ml生理盐水重悬细胞。先加入YOPRO-1(10mmol/L, Molecular Probes公司产品) 20ml，室温下孵育10分钟，随后加入20ml Hoechst33342(0.5mg/L, 美国Sigma公司)，混匀后放室温避光孵育5分钟。孵育结束后取细胞悬液滴于载玻片上，封片后在荧光显微镜(Olympass, BG-12)下计数200个细胞中的凋亡细胞，计算凋亡细胞百分率。YOPRO-1仅使凋亡细胞着为绿色；Hoechst33342可使活细胞、凋亡细胞及死亡细胞均着为蓝色。
5. 统计分析用t或t′检验。
结 果
1.慢性乙型肝炎患者PBL凋亡率：体外培养48小时后，正常组PBL自发性细胞凋亡率为(7.3±0.7)%，病例组为(15.2±5.5)%。用SEB刺激48小时后，正常对照组PBL凋亡率为(12.0±1.4)%，病例组为(20.1±5.0)%。用rHBcAg刺激48小时后，正常对照组PBL凋亡率为(11.7±1.0)%，病例组为(24.6±6.1)%。
无论单独培养还是用SEB或rHBcAg刺激培养48小时后，病例组PBL凋亡率均明显高于正常对照组。两组之间差异均有非常显著性，P<0.01(图1)。
图1 正常人与慢性乙型肝炎患PBL者调亡率的比较
2.SEB与rHBcAg诱导慢性乙型肝炎患者PBL凋亡的比较：用SEB或rHBcAg刺激48小时后，正常组PBL凋亡率分别为(12.0±1.4)%和(11.7±1.0)%，两者之间差异无显著性，P>0.05。但用SEB或rHBcAg刺激48小时后，病例组患者PBL凋亡率分别为(20.1±5.0)%和(24.6±6.1)%，两者之间差异有非常显著性，P<0.01，表明rHBcAg对慢性乙型肝炎患者PBL凋亡的诱导作用明显高于SEB。
3.慢性乙型肝炎患者体内HBV复制与PBL凋亡的关系：体外培养48小时后，HBeAg(+)组凋亡率为(19.2±3.0)%, HBeAg(-)组为(9.3±0.9)%; 用SEB刺激48小时后，HBeAg(+)组为(23.6±2.9)%, HBeAg(-)组为(14.9±1.3)%; 用rHBcAg刺激48小时后，HBeAg(+)组为(27.5±4.7)%，HBeAg(-)组为(17.9±0.8)%。
无论单独培养还是用SEB或rHBcAg刺激培养48小时后，血清HBeAg(+)组患者PBL凋亡率均明显高于HBeAg(-)组。两组之间差异有非常显著性，P<0.01。
4.慢性乙型肝炎患者肝损伤程度与PBL凋亡的关系：将慢性肝炎患者分为肝损伤轻度组和重度组。轻度组包括慢性肝炎轻度和慢性肝炎中度患者，重度组包括慢性肝炎重度和慢性重型肝炎患者。
体外培养48小时后，轻度肝损伤组患者PBL自发性细胞凋亡率为(20.1±0.9)%，重度组为(11.1±3.9)%。用SEB刺激48小时后，轻度肝损伤组患者PBL凋亡率为(24.4±1.2)%，重度组为(15.1±1.3)%，用rHBcAg刺激48小时后，轻度肝损伤组患者PBL凋亡率为(30.0±1.4)%。重度组为(8.4±1.3)%。无论单独培养还是用SEB或rHBcAg刺激培养48小时后，轻度肝损伤组患者PBL凋亡率均明显高于重度组。两组之间差异有非常显著性，P<0.01。
讨 论
结果表明，慢性乙型肝炎患者存在着外周血淋巴细胞凋亡。淋巴细胞减少或活性下降均不利于HBV的清除，这可能是导致HBV持续感染的重要因素之一。
病毒感染可导致宿主淋巴细胞产生“活化诱导的细胞死亡”[1] 。HBV感染可能也是通过“活化诱导”机制引起慢性乙型肝炎患者PBL凋亡的重要因素。本研究表明患者PBL凋亡与HBV感染有关。活化诱导的淋巴细胞死亡机制尚不完全清楚，可能与T细胞抗原受体(T-cell antigen receptor, TCR)异常活化有关。PBL对各种抗原的亲合力不同，弱亲合力抗原虽可刺激TCR，但并没有完全使淋巴细胞活化，而是使细胞处于一种凋亡敏感状态。当PBL再次遇到弱亲合力抗原或遇到强亲合力抗原时即可触发这种凋亡敏感淋巴细胞的死亡[2] 。此外，成熟T细胞上表达有Fas，活化T淋巴细胞则不仅表达Fas配体(FasL)，而且Fas表达明显增强。因此由Fas和FasL介导细胞凋亡可能也是HBV感染者PBL凋亡的重要因素之一[3] 。慢性肝炎重度或慢性重型肝炎患者比慢性肝炎轻度或中度患者的PBL凋亡率低，表明患者PBL凋亡率下降则有利于HBV的清除，但也易加重肝组织的免疫病理损伤，而PBL凋亡率升高易使HBV在体内持续感染。
作者简介： 季伟 男，39岁，副主任医师，博士。1998年获中华医学会中青年肝病科研文二等奖。
参考文献
1 Saha K, Yuen PH, Wong PKY. Murine retrovirus-induced depletion of T cells is mediated through activation-induced death by apoptosis. J Virol, 1994, 68: 2735-2740.
2 Russell JH, White CL, Loh DY, et al. Receptor stimulated death pathway is opened by antigen in mature T cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 2151-2155.
3 Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995, 267: 1449-1456.
(本文编辑：金生 校对：袁平戈)
(收稿：1998-11-30 修回：1998-02-25)
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