关键词：
【摘要】 目的 检测增生性瘢痕(H)和瘢痕疙瘩(K)组织中TGF-β1 及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达，了解其相互关系及意义。方法 斑点杂交分析检测H和K组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原及TGF-β1 mRNA稳态水平的改变；原位杂交检测TGF-β1 mRNA在组织中的空间分布。结果 ①K和H组织中TGF-β1 mRNA稳态水平明显高于N组和S组；②K选择性Ⅰ型前胶原mRNA表达增强，而H组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原mRNA表达均增强。结论 TGF-β1 在H和K的发病机理中起了重要作用，K和H发生发展中具有不同的分子机理。
Changes in TGF-β 1 and type Ⅰ，Ⅲ procollagen gene expression in keloid and hypertrophic scar
TANG Shijie* , PANG Sufang, CAO Ya,et al. The Department of Burn and Plastic Surgery,The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041
【 Abstract 】 Objective The expression of mRNA for TGF-β 1 ,type Ⅰ,Ⅲ procollagen in keloid and hypertrophic scar was investigated in order to elucidate the pathogenesis of and the difference between keloid and hypertrophic scar.Method Dot-blot hybridization analysis was used to examine the type Ⅰ,Ⅲ procollagen and the expression levels of steady-state mRNA.In situ hybridization allowed direct assessment of the distribution of TGF-β 1 mRNA in the tissue.Results ①Our study indicated that the expression level of mRNA for TGF-β 1 significantly increased in keloid and hypertrophic scar compared with normal scar and normal skin.②In keloid tissues,type Ⅰ precollagen mRNA expression was selectively increased.However,in hypertrophic scar,type Ⅰ and Ⅲ collagen mRNAs expressions were simultaneously increased.Conclusion TGF-β 1 plays an important role in the pathogenesis of keloid and hypertrophic scarring.It implicates that distinct molecular mechanisms are operative in the development of keloid and hypertrophic scarring.
【 Key words 】 Hypertrophic scar Keloid mRNA expression Collagen TGF-β 1
增生性瘢痕(H)和瘢痕疙瘩(K)是皮肤损伤后主要以胶原蛋白沉积为特征的病理性真皮纤维化，两者具有不同的临床表现和生物学行为，对其发病机理尚不完全清楚。有研究表明：在一些纤维化疾病中不仅显示出过量的细胞外基质的堆积，而且还有TGF-β1 的增高[1] ，但是TGF-β1 在瘢痕组织中的表达研究不多。为此，我们采集H和K的活体组织标本，运用分子杂交技术，对TGF-β1 及胶原蛋白基因表达进行研究，以了解其相互关系及意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象
本研究病例来源于在我院行整形手术的患者。H、K根据“是否超出原病变位置”向四周邻近皮肤扩张侵袭结合病史及临床表现作出鉴别。正常瘢痕是指无红肿痛痒，与周围皮肤平齐质软的瘢痕，其中K、H、正常瘢痕(N)、正常皮肤(S)各6例。所有选择的研究对象均没有全身结缔组织疾病及重要脏器器质性病变，局部无溃疡，无感染。
1.2 斑点杂交
1.2.1 组织总抽提RNA 参照TRIZOLTM Reagent总RNA抽提试剂盒说明书提供方法。
1.2.2 cDNA探针标记 参照文献[2]的方法，以α-P32 -duTP为标记物，用随机引物法标记，检测放射比活性大于1×108 μg. min-1 。 TGF-β1 cDNA，片段大小为1.05kb，重组位点为EcoR Ⅰ的PSP65重组质粒；编码人Proα1(Ⅰ)cDNA片段大小为1.3kb，插入Puc18载体质粒(美国David Rowe实验室赠送)，重组位点为Pst Ⅰ/BamHⅠ；编码人Proα1(Ⅲ)cDNA片段大小为4.5kb，载体Bluscript，重组位点为EcoRⅠ(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所刘秉慈教授提供)。
1.2.3 斑点杂交 参照文献[2]的方法略加改进。样品RNA20μg，抽滤加样器斑点上样，分别点4张硝纤膜。杂交，洗膜，夹片，于-70℃曝光7天，杂交后的放射自显影斑点用计算机彩色图像分析系统分别检测并计算各mRNA相对含量。斑点杂交图谱见图1。
图1 K、H、N、S组织中TGF-β1 、Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达斑点杂交分析图谱
Fig 1 Dot blot analysis of mRNA for type Ⅰ procollagen,type Ⅲ procollagen and TGF-β1 in six parts of keloid(K),hypertrophic scar(H) and normal scar(N) and normal skin(S) tissues.Total RNA was extracted by using TRIZOLTM Regent and applied to nitrocellulose filters by using Dot Filtration Manifold.The filters were hybridized with cDNA probe for GADP(A),proα1(Ⅰ)(B),andpro α1(Ⅲ)(C),TGF-β1 (D). The GADP served as a internal control probe.As indicated Lanes1,2(K),Lanes3,4(H),Lanes5,6(N),Lanes7,8(S)
1.3 原位杂交
cDNA-mRNA原位杂交参照湖南医科大学肿瘤研究所已建立的方法略加改进。采用非同位素地高辛随机引物法标记探针，检测标记效果。7μm厚连续冰冻切片，10μg/ml蛋白酶K消化10min,预杂交、杂交，每片含6ng探针杂交液滴片，底盐浓度梯度洗片减低背景、免疫检测、核固红复染5min。阳性结果为细胞内出现紫蓝色颗粒，阴性细胞经衬染后，仅见胞核内深红色，胞浆淡红色，未见紫蓝色杂交颗粒。于100×光镜下观察阳性信号在组织中的分布情况。设无探针杂交及无抗体杂交阴性对照。
1.4 统计学处理方法
D检验法进行正态性检验，计算统计量χ2 值进行多个方差齐性检验，两两比较采用方差分析Q检验。
2 结果
2.1 斑点杂交结果
TGF-β1 及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA相对含量见表1。
表1 K、H、N、S组织中TGF-β1 、Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA相对
含量及Ⅰ/Ⅲ前胶原mRNA比值(x +s)
Tab 1 The relative concentration of mRNA for TGF-β1 and
type Ⅰ、Ⅲ precollagen in K、H、N、S groups
| 分组 | 例数 | mRNA相对含量 | |||
| proα1(Ⅰ)mRNA | proα1(Ⅲ)mRNA | Ⅰ/Ⅲ mRNA | TGF-β1 | ||
| K | 6 | 17.347±0.236 | 2.133±0.236 | 8.164±0.3 | 1.204±0.243 |
| H | 6 | 11.865±1.325 | 7.201±1.109 | 1.666±0.201 | 1.197±0.237 |
| N | 6 | 2.65 ±0.5 | 1.734±0.206 | 1.545±0.212 | 0.327±0.081 |
| S | 6 | 1.859±0.208 | 1.364±0.207 | 1.34 ±0.173 | 0.331±0.078 |
结果表明K组和H组中TGF-β1 mRNA含量是N组和S组的3～4倍，(P<0.01),H组和K组比较差异无显著意义(P>0.05);K组和H组Ⅰ型前胶原mRNA表达水平明显增高，与其它三组比较差异有非常显著意义；H组Ⅲ型前胶原mRNA稳态水平明显高于其它三组，差异有非常显著意义；K组Ⅰ、Ⅲ前胶原mRNA比值明显高于其它三组，差异有非常显著意义。而H组与N组和S组的Ⅰ/Ⅲ前胶原mRNA比较差异无显著意义。
2.2 TGF-β1 mRNA原位杂交
K组织中在真皮网状层上部可见TGF-β1 mRNA阳性信号、血管内皮细胞、血管周围的成纤维性细胞及一些圆鼓形核炎性细胞均可见阳性信号(图2)。H组织真皮层可见散在分布的成纤维细胞及圆鼓形核炎性细胞，血管内皮细胞及血管周围成纤维性细胞有丰富的TGF-β1 mRNA阳性紫蓝色颗粒(图3)。而N和S组织中未见明显阳性信号(图4)。
图2 瘢痕疙瘩组织中TGF-β1 mRNA阳性信号主要位于网状真皮层上部，血管内皮细胞有阳性表达，一些圆形核细胞可见阳性信号
Fig 2 Demonstration of TGF-β1 mRNA expression in keliod tissue. The cDNA-mRNA positive signal were localized in upper dermis including fibroblast、microvascular endothlial cell and ball-shaped cell
图3 增生性瘢痕组织中TGF-β1 mRNA阳性信号弥散分布于真皮成纤维细胞中，血管内皮细胞也有阳性表达图
Fig 3 Expression of TGF-β1 mRNA in hypertrophic scar lession. The hybrdization signal were localized in numerouus fibroblast、microvascular endothlial cell and ball-shaped cell diffusely distributed throughout the scar lession
图4 正常瘢痕和正常皮肤组织中未见明显TGF-β1 mRNA阳性信号(×100)
Fig 4 In normal scar and normal skin, there weren't signal detected
3 讨论
3.1 H、K组织中TGF-β1 mRNA持续高水平表达
胶原蛋白分子的异常合成与沉积是纤维化反应的基础[3] ，胶原蛋白基因表达受诸多生长因子和细胞因子调控。本研究斑点杂交结果显示：H和K组织中TGF-β1 mRNA的稳态水平明显高于S和N组，并伴随有Ⅰ型胶原蛋白mRNA的稳态水平的增高。转录水平的调节增高可导致蛋白表达增强，TGF-β1 在体内可以刺激成纤维细胞胶原蛋白产生及mRNA稳态水平增高。本研究的原位杂交结果显示H和K组织中炎性细胞、血管内皮细胞和与之相邻的成纤维细胞可见大量的TGF-β1 cDNA-mRNA杂交阳性颗粒。有研究者认为血管的损伤导致血管内皮细胞的激活并表达TGF-β1 mRNA，可能是导致H和K形成的早期反应之一。由TGF-β1 介导的血管内皮细胞的初始反应，通过与血管相邻的细胞外基质成纤维细胞表达TGF-β1 mRNA而被放大，导致链锁效应[1，4] 。TGF-β1 的自诱导产生能力最终导致正常组织结构的破坏，在慢性进行性瘢痕的发展过程中起了重要作用。有研究表明在纤维化增殖失调疾病中过量的细胞外基质沉积与局部合成的生长因子和细胞因子的促纤维化形成作用有关[1] 。因此可以推测H、K的胶原蛋白异常合成及沉积与Ⅰ型胶原蛋白mRNA的稳态水平的增高有关，并受TGF-β1 的异常调节。在H和K基质中TGF-β1 蛋白及TGF-β1 mRNA表达增高，提示这一细胞因子将持续存在于H和K基质中，不断刺激成纤维细胞诱导基质产生，导致过度的ECM沉积的纤维化反应。随着人们对TGF-β1 在纤维化发生中作用认识的深入，为抗TGF-β1 作用防治瘢痕提供了良好的理论依据，将为临床治疗H和K开辟治疗的新领域。
3.2 H、K组织中Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的改变及意义
H和K具有不同的临床表现和生物学行为[6] 。在胶原基因表达差别上表现为H Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的稳态水平均增高，而K有选择性的Ⅰ型胶原蛋白和proα1(Ⅰ)mRNA稳态水平的增高，导致两者Ⅰ/Ⅲ胶原mRNA比例的差异。对无瘢痕愈合胎儿的细胞外基质研究发现，胎儿皮肤胶原蛋白含量低于成年皮肤组，胎儿真皮层以Ⅲ型胶原为主，随着孕龄越长，Ⅰ/Ⅲ胶原比增高，呈现出由无瘢痕→过渡期瘢痕→瘢痕愈合的过程[5，7] 。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白是主要的间质胶原，在人体的ECM结构组成中起了重要作用，其组成的改变将导致其生物学行为的异常[3] 。通常Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在愈合的创面真皮表达，Ⅲ型胶原蛋白在伤后数月内就开始下降，说明创面愈合过程中胶原的合成有时间性控制[5，8] 。H Ⅲ型胶原蛋白的持续表达，提示正常愈合结果的改变，但随时间的推移可以自然软化。K有选择性的Ⅰ型胶原蛋白和proα1(Ⅰ)mRNA稳态水平的增高，导致Ⅰ/Ⅲ前胶原mRNA比例明显增高，提示其具有不同的分子机理。可以认为胶原基因表达的改变导致了胶原蛋白的异常聚集，直接或间接抑制胶原基因的转录从而抑制胶原蛋白的合成将是治疗H和K的有效方法。通过调节K组织中Ⅰ、Ⅲ胶原基因表达的比例有可能使其向自然软化的趋势转变。
参考文献
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(收稿：1998-09-11 修回:1999-04-25)
, http://www.100md.com