关键词：氨基酸类；D-正白氨酸；2；4-二硝基氟苯；电泳
【摘要 】 目的 建立快速测定人血清中游离氨基酸的方法。方法 用高效毛细管电泳法检测了 40例健康人， 32例肾病患者血清氨基酸。结果 在 8分钟内分离 16种氨基酸，线性在 10～ 700 μ mol/L范围，最低检出限为 2.5～ 7.9 μ mol/L，回收率为 86.3%～ 107.4%，批内精密度为 2.8%～ 10.3%，批间精密度为 3.5%～ 11.6%。对 32例肾脏病患者血清中氨基酸测定结果与 40例正常人对照组氨基酸测定值进行统计分析。结论 高效毛细管电泳法具有快速、准确、灵敏等特点，为临床及科研工作中测定氨基酸提供了一种有效的方法。
A rapid high performance capillary electrophoretic method for determination of free amino acids in serum Shen Zuojun* , Wu Lin. * National Center for Clinical Laboratory, Beijing Hospital Compound, Beijing 100730
【 Abstract 】 Objective To develop a rapid assay for the determination of free amino acids (AAs) in serum. Methods The assay was based on precolumn derivatization of AAs and internal standard with 2,4-dinitrofluorobenzen(DNFB), separation of the derivatives by high performance capillary electrophoresis (HPCE), and quantification by ultraviolet detection. Results The complete separation of 16 kinds of AAs was achieved within 8 min. The assay was linear from 10 to 700 μ mol/L. The minimal detection limit was 2.5～ 7.9 μ mol/L. The recovery of AAs added to serum samples was 86.3%～ 107.4%. Within-run precision was 2.8%～ 10.3%, and between-run precision was 3.5%～ 11.6%. The AAs concentrations in serum of 32 patients with chronic renal failure were measured. Among them, the levels of serine, isoleucine and valine were significantly lower than those of healthy volunteers (P<0.01), but the amounts of cystine, tryptophan and phenylanine were significantly higher than those of healthy volunteers (P<0.01). Conclusions HPCE has many advantages such as rapidity, simplicity, accuracy and sensitivity. The method can be used for determining AAs in clinical practice and scientific research.
【 Key words 】 Amino acids D-Norleucine 2,4-Dinitrofluorobenzen Electrophoresis
在临床上，氨基酸测定不仅对遗传代谢性疾病、肾病、肝病的诊断和治疗具有重要的价值[ 1] ，而且近年来在评价病人营养状况方面亦受到广泛重视[ 2] 。为研究不同疾病状态下氨基酸的代谢情况[ 3， 4] ，需要一种快速测定氨基酸的方法来满足大批量样品检测的需要。氨基酸分析常用的离子交换色谱法和反相高效液相色谱法因其成本高且费时而难以普及。相比之下，最新发展起来的高效毛细管电泳法以其快速、简便、准确、成本低等诸多优点备受青睐，为快速测定氨基酸提供了有效手段。作者采用高效毛细管电泳法，建立了快速检测人血清中游离氨基酸的方法，经实际应用获得满意效果。
材料与方法
一、仪器
1.高效毛细管电泳仪： P/ACE 5500型，美国 BECKMAN公司生产。
2.pH计： ORION 520A。
3.石英毛细管：内径 75 μ m ，河北永年光导纤维厂生产。
二、试剂
1.16种氨基酸标准物、 D-正白氨酸、 2， 4-二硝基氟苯 (DNFB)、 30%Brij35为美国 Sigma公司生产。
2.0.5 mol/L pH 9.5四硼酸钠缓冲液、 0.03 mol/L pH 9.8硼酸钠缓冲液自配。
图 1 氨基酸标准品的毛细管电泳分离图谱
图 2 人体血清中游离氨基酸的毛细管电泳图谱
3.乙腈为色谱纯、异丙醇为 AR级。
三、方法
1.标本采集与处理：取空腹血液 3 ml，离心后取血清 1 ml，加内标 (10 mmol/L D-正白氨酸 )20 μ l，加乙腈 1 ml，混匀，离心去蛋白，上清液备用。不能及时分析的样品需 -20℃冷冻保存。
2.衍生化方法： (1)衍生化反应原理：在碱性条件下，氨基酸中的氨基能定量地与 DNFB反应生成二硝基苯氨基酸衍生化产物，在 360 nm处有最大吸收，紫外检测定量。 (2)衍生化步骤：取尖底带盖玻管，加 0.5 mol/L pH 9.5硼酸钠缓冲液 1 ml，乙腈 1 ml，待测标本的上清液或氨基酸标准液 1 ml， DNFB 20 μ l，混匀，至 50℃水浴 40分钟。
3.分离条件： (1)操作缓冲液的组成： 0.03 mol/L pH 9.8四硼酸钠缓冲液：异丙醇： 30% Brij35=825∶ 150∶ 25。 (2)开口石英毛细管：总长度为 370 mm，有效长度为 300 mm，内径为 75 μ m。 (3)电压： 28 kV。 (4)温度： 15℃。 (5)进样：压力进样 5秒。
4.结果计算：将 16种氨基酸标准液稀释成 10、 50、 100、 300、 500和 700 μ mol/L 6个不同浓度，测定后以氨基酸浓度 ( μ mol/L)为横坐标，峰高响应值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测样品的峰高响应值查表即得样品的氨基酸含量。
实验结果
一、氨基酸的分离
1.氨基酸标准品的分离：将 16种氨基酸标准液，其中精氨酸 (Arg)、酪氨酸 (Tyr)、赖氨酸 (Lys)、色氨酸 (Trp)、组氨酸 (His)、苯丙氨酸 (Phe)、异亮氨酸 (Ile)、亮氨酸 (Leu)、蛋氨酸 (Met)、缬氨酸 (Val)、丝氨酸 (Ser)、苏氨酸 (Thr)、脯氨酸 (Pro)、丙氨酸 (Ala)、甘氨酸 (Gly)各为 100 μ mol/L，胱氨酸 (Cys)为 50 μ mol/L，内标 (IS)为 200 μ mol/L进行衍生化反应，然后电泳分离。由图 1可见 16种氨基酸和内标在 8分钟内达到完全分离。
2.人体血清中游离氨基酸的分离：人血清标本经乙腈去蛋白后衍生化反应，直接进样分析。由图 2可知，血清中其它成分对所要测定的氨基酸无明显的干扰。
二、线性范围
将 16种氨基酸标准液稀释成 10、 50、 100、 300、 500和 700 μ mol/L 6个不同浓度，测定后进行线性回归，计算其相关系数 r在 0.964～ 0.995之间。结果表明 16种氨基酸在 10～ 700 μ mol/L范围内线性良好。
三、精密度
取一份正常人血清标本，分别做批内和批间误差测定。批内测定时，同一份样本同时测 12份，作为批内精密度观察指标，结果氨基酸测定变异系数在 2.8%～ 10.3%之间；批间测定时，不同时间共测 10批，作为批间精密度观察指标，结果氨基酸测定变异系数在 3.5%～ 11.6%之间。
四、检测限
计算基线噪音相应于信噪比为 2 (S/N=2)时的浓度即为最低检测限，在 2.5～ 7.9 μ mol/L之间。
五、回收率
取一份正常人血清标本，分别加入 50 μ mol/L和 200 μ mol/L两种浓度的氨基酸标准液，测得平均回收率在 86.3%～ 107.4%之间。
六、参考值
用本法对 40名健康人血清中 16种游离氨基酸进行参考值调查，其中男性 20名，年龄 16～ 58岁；女性 20名，年龄 17～ 62岁。血清氨基酸含量见附表。
附表 正常人和肾病患者组 16种血清氨基酸测定结果的比较 ( 
±s,μ mol/L)
| 氨基酸名称 | 正常人组 (n=40) | 肾病患者组 (n=32) |
| 精氨酸 | 108.3±30.4 | 104.7±28.3 |
| 酪氨酸 | 65.8±12.7 | 54.2±10.6 |
| 赖氨酸 | 209.1±38.5 | 197.5±43.2 |
| 色氨酸 | 35.2±7.6 | 94.8±26.7* |
| 组氨酸 | 81.4±11.3 | 86.5±29.1 |
| 苯丙氨酸 | 61.5±8.2 | 94.8±23.7* |
| 异亮氨酸 | 94.8±43.6 | 41.3±18.5* |
| 亮氨酸 | 124.7±30.5 | 115.2±27.6 |
| 胱氨酸 | 21.3±8.4 | 274.3±76.4* |
| 蛋氨酸 | 31.3±7.4 | 35.2±10.5 |
| 缬氨酸 | 249.8±41.5 | 181.9±78.6* |
| 丝氨酸 | 127.4±35.8 | 48.3±20.5* |
| 苏氨酸 | 119.2±28.0 | 121.4±30.7 |
| 脯氨酸 | 205.3±58.4 | 230.1±63.5 |
| 丙氨酸 | 406.7±81.3 | 382.4±84.7 |
| 甘氨酸 | 238.0±51.4 | 259.6±62.3 |
七、临床应用
用本法测定 32例肾脏病患者血清游离氨基酸，其中男性 15例，年龄 34～ 56岁，女性 17例，年龄 29～ 51岁。测定结果与正常人比较，经统计学处理 (均数 t检验 )，发现该类患者的丝氨酸、异亮氨酸和缬氨酸明显低于正常人 (P<0.01)；而胱氨酸、色氨酸和苯丙氨酸明显高于正常人 (P<0.01)，尤以胱氨酸最为显著，见附表。
讨论
1.氨基酸传统分析方法为离子交换色谱法[ 5] ，该法操作繁琐，成本高，费时，一次分析常需数小时之久。目前氨基酸测定方法多用反相高效液相色谱法[ 6， 7] ，该法虽较传统法有较大改进，但仍有明显不足，一次分析周期常需一小时左右，成本也较高。高效毛细管电泳法是近几年才发展起来的新技术，其分离效能高，快速，试剂消耗量少，是一种十分有效的分离方法。我们对分离条件和衍生化反应进行系统探索，结果无论是分离效果还是分离时间均明显优于国外报道的同类方法[ 8， 9] 。
2.由于大多数氨基酸本身不具有紫外吸收，也不发射荧光，因此，需制成能够被检测的衍生物才能进行测定。氨基酸的衍生化方法有多种，最常用的为邻苯二甲醛法[ 10] ，但该法不够稳定，且不能与二级氨基反应。本研究采用的 2， 4-二硝基氟苯法最初被用来进行氨基酸的测序[ 11] ，该法稳定、摩尔吸光系数大、且能与二级氨基反应。其不足之处是与谷氨酸的衍生化反应较慢。
3.本分离方法是采用区带毛细管电泳法，在操作缓冲液中，我们加入了异丙醇作为有机改性剂，提高选择性，使分离效果得到明显改善。同时还加入表面活性剂 Brij35，不仅提高了氨基酸测定的分离度，而且显著缩短分析时间。
4.本研究旨在建立血清中氨基酸分析方法，故标本要经过去蛋白处理步骤，由此可能造成待测组份的损耗。为消除此影响，我们选择了 D-正白氨酸作内标，取得了满意的效果，方法的各项性能指标均优于外标法。
参考文献
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10Garcia Alvarez-Coque MC, Medina Hernandez MJ, Villanueva Camanas RM, et al. Formation and instability of o-phthaladhyde derivatives of amino acids. Analytical Biochemistry, 1987, 178:1-7.
11沈同，王镜岩，赵邦悌等 .生物化学 .第二版 .北京：高等教育出版社， 1990： 116-117.
(收稿： 1997-12-16 修回： 1998-03-10)