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关键词：哮喘；脂多糖；甲双吡丙酮；豚鼠；运动性哮喘模型
【摘要 】 目的 建立一种接近临床特点的运动性哮喘动物模型。方法 豚鼠27 只分4 组。实验组(A 组) 用脂多糖(1 mg/kg) 和甲双吡丙酮(50 mg/kg) 腹腔注射,4 天后测定气道阻力和动态肺顺应性基础值,8 小时后进行运动试验并复测上述指标。对照组有3 组(B 、C 、D 组); 分别为腹腔注射脂多糖和甲双吡丙酮不运动组、腹腔注射生理盐水运动组和腹腔注射生理盐水不运动组。结果 实验组豚鼠在运动后肺阻力增高、动态肺顺应性降低, 而3 个对照组上述指标变化均无统计学意义。结论 脂多糖和甲双吡丙酮腹腔注射可诱发形成豚鼠运动性哮喘模型。
A model forexercise-induced asthma in guinea pigs with lipopolysaccharide and metyrapone
Liang Yongjie, Cai Yingyun, LiLiandi, et al.Zhongshan Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai 200032
【Abstract 】 Objective To investigate the relationship between airway inflammation andexercise-induced asthma (EIA), an experimental model for EIA in guinea pigs was developed.Method 27 guinea pigs wasdevided into 4 groups. A)LPS+MET exercise group (n=7) had been pretreated withlipopolysaccharide (LPS 1 mg/kg, ip) and metyrapone (MET 50 mg/kg,ip) on the first day.Then lung resistance (RL) and dynamic compliance (Cdyn) were measured before and afterexercise on the fourth day. B)LPS+MET non exercise group (n=6) that pretreated with LPSand MET had nonexercise on the 4th day. C)NS exercise group (n=7) pretreated with normalsaline (NS 1 mg/kg, ip) on the 1st day. RL and Cdyn were measured before and afterexercise on the 4th day. D)NS nonexercise group (n=7) that pretreated with NS had noexercise on the 4th day.Result In LPS+METexercise group RL increased and Cdyn reduced significantly after exercise. In another 3control groups there were no such changes either in RL or in Cdyn. Conclusion These observations suggest that the treatment with LPS andMET could make a model for exercise-induced asthma.
【Key words 】 Asthma Lipopolysaccharide Metyrapone Guinea Pigs Exercise-inducedAsthma
运动性哮喘(EIA) 是一种气道高反应性的表现, 在临床上并非罕见。运动激发试验可作为支气管哮喘诊断或药效评价的手段。运动性哮喘发病机理复杂, 尚未完全阐明。建立运动性哮喘动物模型有助于进一步开展支气管哮喘的研究。至今国内未见运动性哮喘豚鼠模型制作的报道, 而国外通常应用等CO2 过度通气模拟运动性哮喘[1 ，2 ] , 但该方法与运动性支气管哮喘机制不尽相同。我们应用脂多糖(LPS) 和类固醇11 β- 羟化酶抑制剂甲双吡丙酮(2-Methyl-1,2-di-3-pyridyl-1-propanone ,Metyrapone MET) 制作豚鼠运动性哮喘模型。
材料与方法
1. 动物：27 只豚鼠, 体重320 ～410 g, 雌雄不拘, 分为(1)LPS+MET 运动组(A 组),7 只;(2)LPS+MET 不运动组(B 组),6 只;(3) 生理盐水运动组(C 组),7 只;(4) 生理盐水不运动组(D 组) ，7 只。
2. 仪器和药品：呼吸流速仪(Godart ) ，Fleisch 000 型流速换能器，压力换能器(YZO,1-1 型, 上海医用电子仪器厂) ，电生理信号处理器和微机(Intel PC) 。脂多糖(escherichiacoli serotype 055:B5) 和甲双吡丙酮购于Sigma 公司。
3. 方法：(1)A 组和B 组豚鼠运动实验4 天前分别腹腔注射LPS(1 mg/kg)+MET(50 mg/kg),C 组和D 组豚鼠运动试验4 天前腹腔注射生理盐水(1 ml/kg) 。(2)4 天后豚鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(30 mg/kg), 待四肢软瘫后行气管切开, 安置气管导管( 内径2 mm), 经Fleisch 传感器与呼吸流速仪相连接测定潮气量和气体流量。经口将聚已烯导管插入食管, 管内充盈蒸馏水, 远端置于食管胸腔中段, 近端连接三通开关和压力换能器, 测量食道胸腔段内压替代胸膜腔内压。信号输入微机, 肺阻力和动态肺顺应性数据稳定后开始采样，每分钟1 次, 每次10 秒, 共30 分钟。测量完毕拔除食道导管, 保留气管导管。(3)8 小时后待豚鼠完全清醒A 组和C 组进行运动试验,B 组和D 组不作运动试验。然后再次麻醉, 食道插管, 重复测定肺阻力和动态肺顺应性, 方法同前。从再次麻醉及食道插管到重新采样间隔5 分钟。(4) 运动装置为周长1m 格栅转盘, 放入豚鼠后, 在3 分钟内逐步增快转速，直至每分钟15 转，持续20 分钟。
4. 病理学检查：将肺脏取出，10 %甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE 染色，进行光镜病理学检查。
本实验在6 月份进行, 实验日相对湿度平均为73% 。
5. 统计学处理：实验结果以平均数和标准差( ± s) 表示, 显著性检验采用t 检验。
结果
一、运动前后肺阻力和动态肺顺应性变化
A 组运动前后指标比较, 肺阻力显著增高( 表1), 动态肺顺应性明显下降( 表2), 其余各组上述指标变化均无统计学意义。
二、病理学变化
表1 各组豚鼠肺阻力的变化(
± s)| 项目 | 只数 | 肺阻力(kPa . ml-1 . s-1 ) | |||||
| 1 min | 3 min | 5 min | 10 min | 20 min | 30 min | ||
| A 组基础值 | 7 | 0.015 ± 0.004 | 0.015 ± 0.004 | 0.015 ± 0.004 | 0.017 ± 0.005 | 0.015 ± 0.005 | 0.014 ± 0.004 |
| A 组复测值 | 0.036 ± 0.019 | 0.036 ± 0.018 | 0.037 ± 0.017 | 0.029 ± 0.014 | 0.025 ± 0.012 | 0.023 ± 0.009 | |
| P 值 | <0.05 | <0.05 | <0.01 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | |
| B 组基础值 | 6 | 0.012 ± 0.004 | 0.013 ± 0.004 | 0.013 ± 0.003 | 0.013 ± 0.004 | 0.013 ± 0.005 | 0.013 ± 0.002 |
| B 组复测值 | 0.014 ± 0.003 | 0.013 ± 0.003 | 0.013 ± 0.012 | 0.012 ± 0.005 | 0.012 ± 0.005 | 0.011 ± 0.004 | |
| P 值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | |
| C 组基础值 | 7 | 0.019 ± 0.005 | 0.020 ± 0.005 | 0.019 ± 0.005 | 0.019 ± 0.007 | 0.019 ± 0.007 | 0.019 ± 0.008 |
| C 组复测值 | 0.019 ± 0.006 | 0.018 ± 0.004 | 0.019 ± 0.005 | 0.018 ± 0.007 | 0.019 ± 0.008 | 0.020 ± 0.007 | |
| P 值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | |
| D 组基础值 | 7 | 0.021 ± 0.006 | 0.021 ± 0.006 | 0.021 ± 0.006 | 0.020 ± 0.005 | 0.018 ± 0.004 | 0.018 ± 0.004 |
| D 组复测值 | 0.020 ± 0.005 | 0.019 ± 0.005 | 0.019 ± 0.004 | 0.019 ± 0.004 | 0.017 ± 0.004 | 0.016 ± 0.003 | |
| P 值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | |
表2 各组豚鼠动态肺顺应性变化(
| 项目 | 只数 | 动态肺顺应性(ml . kPa-1 ) | |||||
| 1 min | 3 min | 5 min | 10 min | 20 min | 30 min | ||
| A 组基础值 | 7 | 6.2 ± 2.1 | 6.3 ± 1.8 | 6.8 ± 2.1 | 7.3 ± 2.1 | 7.7 ± 2.1 | 7.2 ± 2.2 |
| A 组复测值 | 3.8 ± 1.2 | 4.1 ± 1.1 | 4.2 ± 1.1 | 4.6 ± 1.2 | 5.6 ± 2.1 | 5.4 ± 2.0 | |
| P 值 | <0.05 | <0.05 | <0.01 | <0.01 | <0.05 | <0.05 | |
| B 组基础值 | 6 | 7.6 ± 1.1 | 7.4 ± 1.1 | 7.9 ± 1.2 | 7.9 ± 1.2 | 7.5 ± 2.1 | 8.6 ± 1.3 |
| B 组复测值 | 8.0 ± 0.8 | 7.9 ± 0.9 | 8.6 ± 0.9 | 8.0 ± 1.2 | 8.8 ± 2.0 | 9.0 ± 1.3 | |
| P 值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | |
| C 组基础值 | 7 | 6.0 ± 0.5 | 6.2 ± 0.8 | 6.6 ± 0.7 | 6.1 ± 0.8 | 6.4 ± 1.6 | 6.5 ± 1.9 |
| C 组复测值 | 6.1 ± 0.9 | 5.9 ± 1.1 | 5.9 ± 0.8 | 6.2 ± 1.2 | 5.8 ± 1.7 | 6.1 ± 1.6 | |
| P 值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | |
| D 组基础值 | 7 | 5.7 ± 1.8 | 5.5 ± 1.8 | 5.6 ± 2.0 | 5.7 ± 1.7 | 6.2 ± 1.6 | 5.9 ± 1.6 |
| D 组复测值 | 5.7 ± 1.8 | 5.6 ± 1.9 | 5.7 ± 1.7 | 6.0 ± 1.5 | 6.4 ± 1.6 | 6.2 ± 1.5 | |
| P 值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 |
讨论
目前对运动性哮喘的发生机理尚不十分清楚, 一般认为运动时过度通气引起气道内衬液层温度下降和水份丢失是其诱因。呼吸的净效应引起水份和热量丢失, 其程度取决于通气量和吸入气体的温度和湿度。运动性哮喘的发生与运动方式、强度、持续时间、运动环境以及呼吸道基础病变有关。健康人在生活环境下, 不会发生运动性哮喘, 而哮喘患者气道存在多种炎症细胞浸润, 运动时过度通气所致的气道温度降低可使支气管平滑肌细胞去极化收缩, 水份的丢失使支气管粘膜呈暂时性高渗状态而增加气道上皮通透性, 使某些大分子物质和抗原容易透过并接近粘膜下的肥大细胞, 使其致敏脱颗粒, 释放多种炎性介质, 诱发气道高反应。炎性介质和高渗状态破坏上皮细胞层, 导致气道粘膜下神经末梢暴露, 使其易受到多种理化因子的刺激, 进而引起胆碱能神经反射、局部轴突反射以及感觉性神经肽如P 物质等释放, 致使支气管痉挛，第一秒用力肺活量(FEV1 ) 较基础值下降超过10 %。
国外报告的运动性哮喘模型一般应用等CO2 过度通气方法诱发, 该法需微型呼吸机，对吸入气体环境要求高, 在实际开展中难以推广, 而且过度通气仅为运动性哮喘发生机制的一部分。本组研究参考有关文献应用促进肺部炎症细胞浸润和降低肾上腺皮质功能的方法制作运动性哮喘动物模型, 结果显示经LPS 和类固醇11 β- 羟化酶抑制剂甲双吡丙酮预处理的豚鼠运动后肺阻力上升, 动态肺顺应性下降。
非特异性气道高反应性是支气管哮喘的常见表现, 嗜酸细胞、肥大细胞、淋巴细胞和中性粒细胞在气道- 肺组织的浸润是非特异性气道高反应性的组织学基础。LPS 可导致气道炎症, 引起炎症细胞在肺部聚集。实验表明腹腔注射LPS 可导致支气管平滑肌收缩, 并损害支气管β- 肾上腺受体, 降低肺组织β- 肾上腺结合位点[3 ，4 ] 。此外血浆皮质醇水平与运动性哮喘的发生也密切相关, 而MET 可抑制肾上腺皮质功能, 协同LPS 进一步增加气道高反应性。Hagai 等[5 ] 曾给豚鼠单独应用LPS 或MET 后进行运动, 结果气道阻力均无变化, 联合应用LPS 和MET 预处理后才诱发运动性支气管痉挛。临床大多哮喘患者气道存在炎症细胞浸润, 缓解期平静状态，FEV1 尚可保持一定水平，运动时张口呼吸和过度通气，形成呼吸道上皮层高渗状态引起炎症细胞脱颗粒而诱发运动性支气管痉挛，FEV1 明显下降。健康人群无气道高反应基础, 故不出现运动性支气管痉挛。本组研究显示经LPS +MET 预处理，A 组在运动后出现支气管痉挛，而B 组虽有气道炎症细胞浸润，但未经运动激发，肺阻力并不增高。C 组和D 组未经LPS+MET 预处理, 因无气道炎症, 无论是否进行运动, 均不能诱使肺阻力上升。该结果与临床所见相一致。
Hagai 应用LPS 吸入制作运动性哮喘模型, 每只豚鼠用0.05%LPS 溶液以3ml/min 速度连续超声雾化吸入30 分钟, 方法繁琐, 所耗LPS 为本方法100 余倍, 费用较高。国内有资料表明豚鼠腹腔注射LPS(1 mg/kg) 后, 异丙肾上腺素对组胺引喘保护作用明显降低, 而且离体气管平滑肌对组胺的收缩反应也较对照组显著增高[6 ] , 提示LPS 腹腔注射可诱发豚鼠哮喘模型。我们在上述研究基础上进一步证明LPS 合并MET 腹腔注射可诱发豚鼠运动性哮喘。本实验不足之处是通过测定食道压间接反映胸膜腔压，须避免空气和食物残渣进入食道插管而出现偏差，操作要求高，但本文方法能同时用于动态肺顺应性测定。
参考文献
1 NagaseT, Dallaire MJ, Ludwig MS. Airway and tissue responses during hyperpnea- inducedconstriction in guinea pigs. Am J Respir Crit Care Med,1994,149:1342-1347.
2 Ray DW, HernandezC,Munoz N,et al. Bronchoconstriction elicited by isocapnic hyperpnea in guinea pigs. JAppl Physiol,1988,65(2)934-939.
3 Folkerts G, Nijkamk FP. Haemophilus influenzaeinduces a potentiated increase in guinea pig pulmonary resistance to histamine. Eur JPharmacol,1985,119:117-120.
4 Schreurs AJM, Verhoef J, Nijkamp FP. Bacterialcell wall components decreases the number of guinea pig lung beta -adrenoceptors. Eur JPharmacol,1983,87:127-132.
5 Nagai H, Iwama T, Mori H, et al. Increase inrespiratory resistance after exercise in conscious guinea pigs. As a model forexercise-induced asthma. Biol Pharm Bull,1995,18(1)37-41.
6 陈剑雄, 吴红霞, 万有, 等. 内毒素在支气管高反应性形成中的作用及其机理的研究. 中华结核和呼吸杂志,1993,16 ：( 哮喘增刊),12
( 收稿：1997-07-31 修回：1997-12-09)