关键词：
基因治疗是近年来的研究热点,它是将有意义的目的基因通过合适的基因转移方法导入受体细胞,借其表达的产物治疗疾病。本文在简要介绍基因治疗基本概况的基础上,就核医学技术在基因治疗中的应用研究现状作一综述。
一、基因治疗的基本概况
1. 基因治疗的主要技术环节。主要包括:目的基因的分离、目的基因导入人体和导入体内基因的表达调控等[1] 。目的基因可由真核细胞、原核细胞或病毒获得,然后利用重组DNA技术,将其插入质粒或病毒性(如腺病毒、逆转录病毒)基因转移载体中,由载体介导将目的基因导入受体细胞中。目前基因治疗的受体细胞仅限于体细胞。将外源基因导入体细胞的方式有3种[2] ,一是体外(exvivo)导入,即从体内取出合适的受体细胞(如淋巴细胞、骨髓细胞、成纤维细胞等),在体外扩增培养后加入基因载体,通过质粒转染或病毒的感染方式将目的基因导入受体细胞,最后将基因修饰过的受体细胞回输至病人体内,带有外源基因的细胞在体内表达,达到治疗目的。二是将外源基因直接导入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞,并表达治疗产物,这称为原位体细胞基因治疗。三是体内导入,即将基因载体直接由血液注入人体内,使其通过转染或感染等方式进入相应的细胞并表达。
2. 基因治疗的分类。根据转移基因的作用方式大致可分为3大类[2] :①矫正和置换,即对缺陷基因的异常序列进行校正,或转移正常的基因来置换异常的拷贝。②基因增补,不去除异常基因,而通过转移正常基因,以补偿缺陷基因的功能。如转移腺苷脱氨酶(ADA)基因,治疗严重联合免疫缺陷症等遗传性疾病；转移细胞因子等免疫调节基因,以增强机体的免疫功能,用于肿瘤治疗等。③阻断基因表达,用诱骗(decoy)转录因子、反基因、反义核酸及核酶等阻断或破坏致病基因的表达。目前基因治疗研究中,应用较多的是第2和第3类方法。
3. 基因治疗面临的若干问题。自1990年首次对严重联合免疫缺陷症病人进行基因治疗以来,至今已有300多个临床治疗草案,人体基因治疗的病例也已达3000余人。然而,基因治疗的疗效并不令人满意,其疗效欠佳的原因是多方面的[3-5] ,如基因转移的靶向困难、转移效率低、病毒性载体的免疫原性等,而对转移基因的体内表达缺乏有效的监测手段,是困扰基因治疗临床研究的1个难题。因为在基因治疗过程中,我们必须了解[6] :①目的基因是否被有效转移；②转移的基因是否分布在相应的靶组织或靶器官；③在靶组织或靶器官中的基因能否有效表达并产生治疗效应；④如果转移的是自杀基因,何时基因表达达最高水平,何时投用前药最佳；⑤在靶组织或靶器官中基因的表达能持续多长时间等,这样才能设计最优化的治疗方案。虽然体外监测基因的表达并不困难,但人体内基因表达的监测则要困难得多[7] ,通常需通过组织活检以获取相应的组织标本,故具有损伤性、所取标本统计学上的异质性以及某些部位难于获取活检标本等缺陷。新近发现利用核医学手段,可望有助上述某些问题的解决。
二、核素显像监测转移基因的体内表达
针对基因治疗中存在的问题,Larson等[6] 首先提出应用非创伤性的核素显像技术来解决基因表达的临床监测问题的可能性,并认为,要实现此目的,需要有合适的“标记基因(markergene)”和“标记底物(marker substance)”。
1.作为标记基因和标记底物应具备的条件。①标记基因通常应是在宿主细胞不存在或不表达的；基因产物是对宿主细胞没有毒性的酶,它可酶解标记底物,且酶促反应的产物能在转导或转染细胞内积聚;②标记底物是和标记基因相匹配的,它是1种在宿主体内不代谢或仅被缓慢代谢的化合物,并不在非转导或转染细胞中积聚,能被合适的放射性核素所标记,以便显像;③标记底物必须易于透过细胞膜,能被基因产物快速代谢,代谢产物在显像期间能有效地沉积于转导或转染标记基因的细胞内;④在转导或转染细胞中积累的标记底物必须能反映基因产物的活性,因此可代表基因表达的水平。目前适合作为基因治疗显像的标记基因主要有在肿瘤、心血管疾病基因治疗中广泛使用的自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk),由于HSV-tk具有较广的底物特异性,较易选择到合适的标记底物。
2. 基因治疗显像研究。与哺乳动物细胞内的胸苷激酶不同,病毒源性的HSV-tk能将非毒性的前药ganciclovir(GCV)转变成磷酸化的GCV,磷酸化的GCV不能自由透过细胞膜,而在细胞内继续被磷酸化成毒性的三磷酸形式,通过参入细胞DNA,阻断DNA的合成来杀伤细胞。新近Tjuvajev等[8,9] 提出,用放射性核素标记GCV的类似物FIAU(2′-fluroro-2′deoxy-1-b-D-arabinofuranosyl-5-iodo-uracil)进行核素显像,可监测自杀基因HSV-tk治疗时的体内表达。将野生型的和转染HSV-tk基因的神经胶质瘤RG2细胞、野生型的和转染HSV-tk基因的肉瘤W256细胞分别注射至大鼠腹部两侧,制备荷瘤动物模型；在另一组实验中,则在已制备的RG2及W256瘤体内,注射能产生含有HSV-tk基因逆转录病毒的包装细胞(packagingcells)。待肿瘤长至合适大小,于静脉注射131 I-FIAU后的24、36、48h,利用γ相机和SPECT仪进行肿瘤显像,发现体内外转染HSV-tk基因的肿瘤内,有高水平放射性分布(>131 I-FIAU剂量的1%)；同时进行的定量放射自显影(QAR)图像分析表明,高水平放射性分布的部位是经免疫组化证实HSV-tk蛋白染色阳性的区域,QAR中FIAU的摄取量与肿瘤细胞中HSV-tk的mRNA表达水平相关。HSV-tk蛋白染色阴性的邻近肿瘤组织、对侧的野生型肿瘤和其它组织内的放射性水平很低(<131 I-FIAU剂量的0.01%)。此外,在HSV-tk染色阳性肿瘤内131 I-FIAU累积量的高低与体外肿瘤细胞株对GCV的敏感性相一致。由此可见,核素显像可以获得转移基因的体内分布和表达强度等方面的信息。
由于PET图像分辨率更高,可提供更多的定量分析资料,用124 I-FIAU进行HSV-tk基因PET显像也获得成功[10] 。为了克服FIAU碘标记物脱碘、在血清中的廓清时间较长等缺陷,又合成了18 F标记的GCV另一类似物18 F-FHPG[9(3-fluro-1-hydroxy-2-propoxy)methyl)guanine]。体外研究发现,在转染HSV-tk基因的9L胶质瘤细胞中,经磷酸化后沉积于HSV-tk(+)细胞内的18 F-FHPG量较HSV-tk(-)细胞高200倍[11] 。将HSV-tk(+)的9L细胞接种至大鼠脑内,注射18 F-FHPG3 h后,瘤体内放射性摄取较脑皮质高19倍。
由于并非所有的治疗基因均适于作标记基因或有合适的标记底物供基因治疗显像,所以Srinivasan等[12] 构建了1种双基因腺病毒载体。在该载体中,治疗基因和作为标记基因的HSV-tk用脑心肌炎病毒的内核糖体进入位点(IRES)序列连接在一起,并受同一启动子控制,这样,治疗基因和标记基因的表达被转录在同一mRNA上,通过监测标记基因的表达便可了解治疗基因的情况。在实验中,将含双基因腺病毒载体静脉注射至小鼠体内,而对照组仅注射含空白表达盒的腺病毒载体,所有的动物均静脉注射标记底物18 F-fluroacyclovir。由于腺病毒通常感染肝细胞,故用PET显像动态观察肝区的放射性变化,并将图像结果与NorthernBlot 检测的肝组织中的HSV-tk mRNA水平进行比较。结果发现,对照组小鼠体内的放射性分布全身,且大部分在60min内经肾脏清除；而实验组小鼠肝脏的放射性于注射示踪剂后2 d达高峰,并在21d内逐步下降,肝脏内放射性的变化趋势与Northern Blot检测所得的变化规律相吻合。此结果表明,基因治疗显像还可获得基因体内表达持续时间等方面的信息。另一种表达双基因的方法是构建融合基因[13] ,这可进一步扩展作为标记基因的HSV-tk在未来基因治疗显像中的应用范围。
三、与放射性核素治疗相结合的基因放射治疗
1. 125 I等核素的辐射生物效应特征为基因放射治疗提供了依据。用放射性核素对肿瘤进行放射治疗是肿瘤治疗的重要手段之一。以电子俘获方式衰变的一些放射性核素,在其衰变过程中可发射出许多低能的Auger电子和CK(Coster-Kronig)电子,如125 I在每次衰变中平均可产生20个能量在15eV～24 keV的电子,具有高线性能量转换(linear energy transfer,LET)特征。125 I-IUdR参入培养细胞DNA后,细胞存活曲线与高LET辐射相似,为无肩直线。与250keV X线相比,其相对生物效应系数达7.3。若125 I的衰变发生在胞浆,则产生低LET细胞存活曲线。有学者经过实验和理论推算后指出,125 I参入DNA中产生的高LET效应,是由于衰变时产生的Auger和CK电子,围绕其衰变位点约10nm(DNA链上约10 bp以内)的范围内形成高度局限能量沉积(335 keV), 引起DNA的双链断裂(DSB)等难以修复的损伤所致,平均每次衰变约可产生1个DSB[14] 。因此,有人形象地把125 I比作是能对DNA进行局部精细切割的“分子手术刀”,其辐射生物效应受到人们的高度重视[15] 。
2. 基因放射治疗的实验研究。在目前进行的基因治疗研究中,针对肿瘤的基因治疗占绝大多数,而HSV-tk基因是选用最多的目的基因。如何进一步提高自杀基因的效果是人们努力的方向。根据基因治疗显像研究取得的结果,有人提出了将基因治疗与放射性核素治疗相结合的基因靶向放射治疗(gene-targetedradiotherapy)新方法[6] 。该方法首先将HSV-tk基因导入肿瘤细胞,然后投用治疗剂量的125 I-FIAU(或其他核苷类似物)。磷酸化后参入DNA中的FIAU一方面可直接阻断DNA的合成,同时125 I的“分子手术刀”样作用又可造成DNA的损伤,使抗肿瘤效应得到加强。由于目前基因转移的效率仍较低,HSV-tk/GCV的抗肿瘤效应有相当一部分是通过“旁观者效应(bystander effect)”机制实现的,即在HSV-tk(+)细胞内形成的单磷酸化的GCV,通过缝隙连接(gapjunction)进入邻近的HSV-tk(-)肿瘤细胞,继而被三磷酸化后参入细胞DNA中,发挥细胞毒效应。但距离较远的或处于非增殖期的HSV-tk(-)肿瘤细胞则不受“旁观者效应”的影响,成为基因治疗失败的重要原因之一。为解决这一问题,可考虑选用释放高能β射线的放射性核素(如90 Y等)对FIAU进行标记。此外,该方法的另一优点是,可以先投用诊断剂量的131 I-FIAU或124 I-FIAU进行显像,根据显像结果决定在合适时间投用合适剂量治疗性标记物,从而做到有的放矢,求得最佳的疗效。
癌基因的突变和扩增是肿瘤发生的重要原因。根据碱基互补原理,利用人工或生物合成的寡核苷酸片断与相应的靶基因或mRNA结合,以阻断致病基因表达的反义技术,是近年来基因治疗的一个重要领域。但随着研究的深入,人们发现面对源源不断而来的mRNA拷贝,反义RNA技术也难以一一阻断或剪断。于是,人们将目光转移到mRNA的源头,试图利用三股形成寡脱氧核苷酸(TFO)片断,与基因组上特定的序列结合,形成三股螺旋DNA,阻断基因的转录,以达到“反基因”的目的[16] 。但实验研究发现,TFO只是1张贴在有害基因上的“封条(blockingstrip)”,不能彻底清除有害基因。将125 I的“分子手术刀”样作用与“反基因”技术相结合,美国NIH Panyutin等[17] 于1994年开始了基因放射治疗(generadiation therapy)的实验研究工作。将125 I标记的互补于HIV nef基因的TFO与含有nef基因片段的质粒共孵育后发现,当形成三股螺旋DNA时,结合在TFO上的125 I确能引起nef基因内的特定序列DNA双链断裂(DSB)；若改变共孵育的离子条件不利于三股螺旋的形成,或以32 P代替125 I对TFO进行标记,则检不出DSB；DSB的断裂位点严格局限于TFO的125 I-IdC标记位点附近的双链DNA上约10bp范围内。据此认为,只要我们知道某一致病基因的序列且其符合三链形成条件,就有可能采用基因放射疗法[18] 。
核医学技术用于基因治疗研究目前仍处于实验阶段,要真正进入临床应用还有较长的路要走。但核医学技术与基因治疗结合,既丰富了基因治疗的研究内容,也为核医学发展注入新的活力。
参考文献
1 陈诗书, 汤雪明.医学细胞与分子生物学. 上海: 上海医科大学出版社, 1995. 553-570.
2 Anderson WF. Human gene therapy. Nature, 1998, 392 Suppl:25-30.
3 Verma IM, Somia N. Gene therapy promises, problems and prospects. Nature, 1997,389:239-242.
4 Blau H, Khavari P. Gene therapy progress, problems,prospects. Nature Medicine,1997, 3:612-614.
5 Hersh EM, Stopeck AT. Advances in the biological therapy and gene therapy ofmalignant disease. Clin Can Res, 1997, 3:2623-2629.
6 Larson SM, Tjuvajev J, Biasberg R. Triumph over mischance: a role for nuclearmedicine in gene therapy. J Nucl Med, 1997, 38:1230-1233.
7 Wiebe LI, Morin KW, Knaus EE. Radiopharmaceuticals to monitor gene transfer. J NuclMed, 1997, 41:79-89.
8 Tjuvajev JG,Finn R, Watanabe K, et al. Noninvasive imaging of herpes virusthymidine kinase gene transfer and expression: a potential method for monitoring clinicalgene therapy. Can Res, 1996, 56:4087-4095.
9 Tjuvajev JG, Avril N, Oku T, et al. Imaging herpes virus thymidine kinase genetransfer and expressing by positron emission tomography. Can Res, 1998, 58:4333-4341.
10 Tjuvajev JG, Finn R, Watanabe K, et al .Imaging in vivo HSV-tk gene transfer andexpression with [124 I]-FIAU. Cancer Gene Therapy, 1996, 3:S30.
11 Goldman S, Monclus M, Cool V, et al. A novel PET tracer for evaluation of genetherapy. J Nucl Med, 1996, 37:53.
12 Srinivasan A, Gambhir SS, Green AL, et al. A PET reporter gene probe technologyfor repeatedly imaging gene expression in living animals. J Nucl Med, 1996, 37:107.
13 Rogulski KR, Zhang K, Kolozsvary A, et al. Pronounced antitumor effects and tumorradisensitization of double suicide gene therapy. Clin Can Res, 1997, 3:2081-2088.
14 Kassis AI, Aselstein SJ, Mariani G. Radiolabeled nucleoside analogs in cancerdiagnosis and therapy. J Nucl Med, 1996, 40:301-309.
15 O'Donghue JA. Strategies for selective targeting of auger electron emitters totumor cells. J Nucl Med, 1996, 37 Suppl:3S-6S
16 Postel EH, Flint SJ, Kessler DJ, et al. Evidence that triplex-formingoligodeoxyribonucleotide binds to the c-myc promoter in HeLa cells,thereby reducing c-mycmRNA levels. Proc. Natl Acad Sci USA, 1991, 88:8227-8231.
17 Panyutin IG, Neumann RD. Sequence-specific DNA double-strand breaks induced bytriplex forming 125 I labeled oligonucleotides. Nucleic Acid Res, 1994,22:4979-4982.
18 Kotz D. 30 years of nuclear medicine at the NIH. J Nucl Med, 1997, 38:13N-26N.
(收稿：1998-09-18 修回：1999-01-13) , 百拇医药