房室结区细胞电生理特性及腺苷对其K+通道的影响

http://www.100md.com 《中国心脏起搏与心电生理杂志》 2000年第3期

姚素波 黄德嘉 华西医科大学附属第一医院心内科 四川成都 610041 中国心脏起搏与心电生理杂志 2000 0 14 3
关键词：腺苷；胶原酶Ⅰ；钾通道；膜片钳；房室结细胞；兔 期刊 zgxzqbyxdslzz 0 171-173 房室结的电生理特性专栏 fur --> /literature/clinic/diagnose/diagnose02.asp?keyword=腺苷；胶原酶Ⅰ；钾通道；膜片钳；房室结细胞；兔 /info/meeting/meeting02.asp?keyword=生理学

摘要 为从细胞水平了解房室结电生理特性以及腺苷对其作用的离子机制，研究急性酶分离的单个房室结细胞钾电流的特性以及腺苷对电流特性的影响。采用膜片钳技术记录单通道电流，此电流经膜片钳放大器(CEZ-2200)放大和低通滤波(3 KHz)，再经Pclamp 6.02软件的数据采集系统采样和最后分析。结果：采用对称性高钾液恒温灌流(36～37 ℃)应用细胞贴附式膜片，发现房室结区有两类细胞，其中一种电导值为23.8 pS的柱状细胞和一种电导值为6.8 pS的梭状细胞。在这两种细胞上均可记录到外向钾电流通道。此电流具有内向整流特性，随去极化水平的增加，其通道开放概率(P_O )增加，且能被10 mM 四乙基胺完全阻断。使用腺苷后此通道的电压依赖性仍存在，且通道开放概率、平均开放时间、开放频率均明显高于对照组，且具有内向整流特性。其反转电位与钾电流相似。结论：房室结内有两种不同电导值的细胞，腺苷使其电流特性的改变与腺苷使膜电位超极化和钾通道(I_kado )活动增加有关。
中图分类号 R329.2⁺ 5 R972⁺ .2 文献标识码 A
文章编号 1007—2659(2000)03—0171—03

Electrophysiological Properties of Cells Isolated From the Rabbit Atrioventricular Node and Effects of Adenosine on Their K⁺ Channel.

YAO Su-bo,HUANG De-jia.

To study electrophysiological properties of cells isolated from the rabbit atrioventricular node (AVN) and effects of adenosine on their K⁺ channel.Calciumtolerant myocytes were isolated from the region of the AV node by enzymatic and mechanical ionic currents was studied using the cell attached configurations of the patchclamp technique.We found that there are two types cells in AVN region.The single channel conductance was 6.8 pS and 23.8 pS in the ovoid shaped and rod shaped respectively.Adenosine (1～50 μmol) slowed or abolished the spontaneous activity with hyperpolarization of the membrane potential.The experiments showed that adenosine induced an inwardly rectifying time independent current.The adenosine induced current was shown to be carried by potassium ions by altered the external potassium.In a high [k⁺ ] solution,inward single channel currents were observed on membrane hyperpolarization.At potentials between -60 mV and 0 mV,the open and closed times of the single channel fitted well with single exponential and biexponential distribution,respectively.As the membrane was progressively hyperpolarized,the open time was prolonged,while the closed time was shortened and increase of open probability,frequence.These results indicate that there are two different electrophysiology characteristic cells.Adenosine suppress spontaneons activity by hyperpolarized membrane potential and induce a time independent potassium current in AV node cell.
Adenosine Collaenase Ⅰ Potassium Channel Patch-clamp Atrioventricular node cell Rabbit

腺苷是细胞各种生理活动的内源性调节剂，在心脏功能方面具有多种调节作用，主要有负性变时、变力、变传导作用。腺苷对心脏的负性变传导作用部位在房室结^[1] ，但其作用的离子机制尚不清楚。本文运用单通道记录技术研究腺苷对房室结各区细胞K⁺ 通道的影响，以便从细胞与分子水平上揭示房室结区的细胞电生理特性。

1 材料与方法
1.1 房室结区细胞的急性分离及鉴定 取体重为1.5～2 kg的大白兔，静脉内注射肝素(1 ml，约5 000单位)，30～60 min后用棒击昏头部，立即取出心脏置入低钙液的小杯内，然后置入Langendorff灌流仪上(自制)，心脏开始有规律的跳动，灌流速度控制在45～72 ml/min，并先后用低钙台式液(μM：NaCl 130、KCl 4.5、MgCl₂ 3.5、NaH₂ PO₄ 0.4、HEPES 5、Glouse 10，加入定量的CaCl₂ 溶液使钙含量达到750 μM，用NaOH调节pH值为7.25)灌流2 min、无钙台式液(μM：NaCl 130、KCl 4.5、MgCl₂ 3.5、NaH₂ PO₄ 0.4、HEPES 5、Glouse 10，pH值为7.25)灌流3 min及含Ca⁺ 80 μM、胶原酶ⅠA型酶(0.35 mg/ml，Sigma公司)台式液灌流6～15 min。一般在8 min后开始从右室尖部打开心脏直到三尖瓣环，上界(todarol键)、后界(冠状窦)与前界(中心纤维体)。按解剖部位分别取房室结区域组织、心房肌和心室肌将其剪碎成1 mm x 1 mm碎块后分装于不同的含KB液试管内，振荡温育和过滤后即可得到形态与光泽良好的房室结区细胞。将所得细胞置于室温下2 h左右即可进行电生理实验。整个灌流系统温度保持在36 ℃左右，且所有液体均用95%O₂ +5%CO₂ 进行饱和。
在急性分离的房室结区细胞内存在大量的梭形细胞(30%)，柱状细胞(29%)，较少的典型的心房肌和心室肌细胞。按细胞大小、形态、动作电位特征以及具有正常自主活动特征与心房肌、心室肌细胞进行比较而获得直径较小、动作电位形态似结区、结希区以及房结区的梭形和柱状两种主要的房室结细胞。
1.2 膜片钳单通道记录技术 采用细胞贴附式和内面向外式两种构型记录细胞通道电流。实验在对称性高钾液[电极外液成分(mM)：K-asp 100、KCl 40、HEPES 10、EGTA 1、CaCl₂ 0.5、Glouse 10，用KOH调节pH值到7.25。电极内液(mM)：K-asp 40、KCl 100、HEPES 10、CaCl₂ 2，用KOH调节pH值到7.25]和药液(用细胞灌流液配成不同浓度的腺苷液)中进行。将急性酶分离的房室结区的细胞悬液吸一滴注入1.5 ml的浴槽内，静息20 min左右，灌以细胞外液冲洗以除去漂浮的死细胞及细胞碎片。溶液温度用恒温水浴箱控制在35～37 ℃，灌流速度为1.5 ml/min。使微电极尖端与细胞形成近似电绝缘，其阻抗约10～100 GΩ，说明巨欧姆阻抗封接(gigaohm ceal)形成。这时的膜片即为实验所用的细胞贴附式膜片。此时，只要轻轻提起电极在空气中暴露几秒钟，然后再回到浴液中，即形成内面向外式膜片。
形成细胞膜片构型后，使用放大器上“V-HOLD”旋钮给予细胞钳制不同的电压水平，电流经微电极探头到膜片钳放大器后，再经数/模转换器(DIGIDATA-1200 AXON INSTROMENT，美国生产)转入计算机进行采样、贮存。放大器增益为100 mV/pA，滤波频率3 kHz。采样方式为“Gap free”，采样间期10 s或30 s。采用Pclamp 6.02分析软件(AXON instrument)对数据进行处理。
1.3 统计学处理 数据用均数±标准差(±s)表示，采用配对t检验及方差分析进行统计学检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果
2.1 房室结细胞上所记录到的电流 在正电位时，几乎未记录到外向单通道电流，而在细胞膜超极化时(即膜电位为负值方向钳制时)记录到一种内向脉冲样电流波动，随着超极化电压的增大，通道电流和通道开放概率也逐渐增加。在柱状和梭状细胞上可记录到不同斜率电导值，柱状细胞为23.8 pS、梭状细胞6.8 pS。随着膜电位从0～60 mV或更大超极化时，记录到一种通道开放概率逐渐增加、电流幅值也逐渐增加、表现出明显电压依赖性的外向电流。在-60 mV电压下在细胞外液中加入10 mM钾通道阻滞剂四乙基胺时，采用内面向外式膜片，可见TEA能完全阻断此类通道电流。
由于梭状细胞电导值的斜率太小，不利于某些通道特性观察，因此下面均用柱状细胞来进行研究。
2.2 房室结细胞电流的内向整流特性 当膜电位向负于钾的平衡电位(E_K )的方向钳制时(超极化)，很容易记录到一种内向的脉冲电流波动，随膜片超极化程度加大，电流幅值也随之增大；与此相反是当膜片电位向正于平衡电位方向发展时(除极)，通常难于记录到通道的开放事件，即使有时记录到电流，其幅值与负于E_K 的对称膜电位水平相比较也低得多，表现出强烈的内向整流特性。随着超极化程度的加大、通道开放概率(P_O )增加，通道平均开放时间(T_O )延长，而通道平均关闭时间(T_C )缩短。通道P_O 和T_O 具有明显的电压依赖性，见表1。

表1 不同钳制电压时的P_O 和T_O 的变化(±s,n=5)

2.3 不同浓度腺苷对房室结细胞通道特性的影响。
2.3.1 腺苷对房室结细胞通道开放频率的影响 细胞贴附式记录时，不同浓度的腺苷在不同钳制电压下，其通道P_O 与对照组相比较基本上都增加。当电压钳制在-40 mV，腺苷在浴液中的终浓度为1，10，50 μM时，其通道P_O 分别增加100.1%、230.5%、630.3%(P<0.01，见表2)。

表2 在钳制电压为-40 mV时不同浓度的腺苷对房室结细胞钾通道电流的影响(±s,n=5)

注：T_c =平均关闭时间，τ_o =开放常数，τ_cf =快关闭常数，τ_cs =慢关闭常数

2.3.2 腺苷对通道T_O 和T_C 的影响 细胞贴附式记录中，随着腺苷在浴液中的终浓度的增加，通道T_O 均有一定延长，而T_C 明显缩短，当钳制电压为-40 mV，腺苷在浴液中的终浓度为1，10，50 μM时，其通道T_O 分别增加9.1%、21.1%、32.5%(P<0.05)，而通道T_C 分别减少31.9%、50.2%、84.8%(P<0.01)(见表2)。
2.3.3 腺苷对通道电流幅值的影响 细胞贴附式记录中，当钳制电压为-40 mV，腺苷在浴液中的终浓度为1，10，50 μM时，其通道电流幅值分别增加0.544±0.326，0.642±0.397，3.586±1.696 pA(对照值为2.285±0.513 pA)。
2.4 腺苷引起房室结细胞单通道电流增加的离子基础 在电流-电压关系曲线上，比较使用腺苷前后的电流值。腺苷引起的电流呈内向整流性，其反转电位随着细胞外钾浓度的减少而增加，如细胞外钾浓度为140～5.4 M，其反转电位相应为0～-100±2 mV。

3 讨论
我们在所分离的房室结区细胞内发现有两类形态和电导值不同的细胞，即梭状细胞和柱状细胞。从研究的结果来看这两类细胞均存在一种与心房肌、心室肌相似的内向整流钾通道特性，柱状细胞的这种具有内向整流特性的电流幅值、电导值为梭状细胞的3倍左右。10 mM钾通道阻滞剂四乙基胺能完全阻断此类通道电流。但我们在房室结细胞上所记录到的单通道电流值明显降低于Clemo等^[2] 在心房肌、心室肌细胞上记录的电流值。这是由于房室结细胞的内向整流性钾通道(I_K1 )较少。
腺苷对房室结细胞影响较大，当细胞外应用此药物时，可完全阻断房室结细胞的自主活动，使膜电位出现超极化。我们进一步在柱状细胞上记录了不同浓度腺苷对此细胞通道特性的影响。研究表明在一定范围内随着腺苷浓度的增加其通道的P_O 也相应增加，通道电流也增加，并显示明显的浓度依赖性，以后逐渐趋于稳定。此外腺苷主要在膜电位超极化下起作用，对膜去极化的影响较小，加入药物后其通道活动仍保持电压依赖性。腺苷增加通道P_O 主要通过增加T_O 或减少T_C 来实现的，特别是T_C 的减少较为明显。
不同浓度腺苷对通道电流幅值也有明显影响，我们观察到用药前后的电流通道中有多水平开放，说明腺苷除增加通道的P_O 外，还增加膜片上通道的开放数量。
腺苷对房室结细胞单通道电流增加的离子机制是引起了时间依赖性钾电流的增加。它与在兔窦房结细胞上^[2] 和在豚鼠心房肌上^[1，3] 以及用全膜在兔的房室结细胞上^[4] 记录的I_kado 相似，它是由钾离子携带且具有内向整流特性。
腺苷对房室结细胞的自主活动的影响在应用腺苷治疗室上性心动过速方面起重要的作用。而产生的自动舒张期去极化的离子基础是什么呢?前人多认为，是由于一系列外向和内向电流相互作用的结果。国外学者用全细胞膜片钳技术对窦房结和房室结细胞上的离子电流进行了研究，结果表明在这些细胞上存在着超极化激活电流(Ⅰ_f )，内向电流(钠电流、钙电流)和外向电流(Ⅰ_k 、Ⅰ_to )以及背景电流(Ⅰ_b )^[4，5] ，而房室结细胞需要维持其自主活动应是上述离子之间相互平衡的结果，而腺苷敏感性电流可以改变它们之间的平衡，以及细胞膜电位的稳定。针对Ⅰ_f 是否在房室结起搏活动中起着重要的作用，国外学者进行了一些研究，基本上认为Ⅰ_f 在单个房室结细胞上缺乏或较少^[4，6] ；我们目前的研究未记录到Ⅰ_f 。
通过单通道活动对腺苷作用于房室结细胞的研究结果表明，腺苷消除房室结细胞的自主活动是与其使膜电位的超极化和引起钾通道(I_kado )活动增加有关。

作者简介：姚素波(1963— )，女(汉族)，四川绵竹人，医学博士，主治医师，专业特长为细胞电生理。

参考文献

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(1999-10-28 收稿) , 百拇医药

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