急性肺损伤大鼠肺组织β和β₂受体及β₂受体mRNA表达的变化

http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第4期

徐兴祥 孙耕耘 钱桂生 第三军医大学新桥医院呼吸内科(重庆 400037) 中国病理生理杂志 1999 0 15 4
关键词：内毒素类；肺；损伤；受体；肾上腺素能β；基因表达；大鼠 期刊 zgblslzz 0 论著 fur -->

摘 要 目的： 观察急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织β、β₂ 受体和β₂ 受体mRNA含量的变化，探讨上述变化与ALI的关系及β₂ 受体变化可能的分子机制。方法： 静注内毒素复制大鼠ALI模型，肺组织β、β₂ 受体及β₂ 受体mRNA含量，分别用放射性配基结合分析法和斑点杂交技术测定。结果： 静注内毒素后1、4、6 h，大鼠肺组织β和β₂ 受体的最大结合容量(Bmax)均明显低于正常对照组(P <0.01)，尤以β₂ 受体为甚；静注内毒素后4及6小时，大鼠肺组织β₂ 受体mRNA含量分别下降至正常对照组的76.4%±19.6%(P <0.01)和52.8%±20.4%(P <0.01)。结论： 肺组织β受体数目的减少在ALI发生发展中可能起一定的作用，β₂ 受体数目的减少可能与ALI关系更密切；β₂ 受体mRNA含量的减少可能是ALI后一定阶段肺组织β₂ 受体数目减少的原因之一。

Changes of beta, beta-2-adrenergic receptor and beta-2-adrenergic receptor mRNA expression in lung tissue during endotoxin-induced acute lung injury
in rats

XU Xing-Xiang,SUN Geng-Yun,QIAN Gui-Sheng
Department of Respiratory Disease, Xing Qiao Hospital, Chongqing (400037)

Abstract AIM： To observe the changes of beta, beta-2-adrenergic receptors(β-AR,β₂ -AR) and beta-2-adrenergic receptor mRNA expression in lung tissue of rat with acute lung injurg (ALI), in order to explore the molecular mechanism of changes of beta-2-adrenergic receptor and the relation between above changes and ALI.METHODS： The model of ALI in rat was established by intravonous injection of E. coli endotoxin (ET). β-AR and β₂ -AR were measured by radioligand binding assay with [³ H]-dihydroalprenolol. The expression of β₂ -AR mRNA of lung tissue in rat was anlysed by dot blot hybridization. RESULTS： (1) The maximal capacity of the receptor (Bmax) of both β-AR and β₂ -AR in the lung tissue decreased significantly at the 1st, 4th and 6th hours after injection of ET. The density of β₂ -AR was much lower than that of β-AR.(2) The expression of β₂ -AR mRNA in lung tissue decreased to 76.4% and 52.8% of the level in control group at the 4th and 6th hours respectively after injection.CONCLUSIONS： (1)The decrease of density of β-AR in lung tissue may play some role in the development of ALI. The reduction of β₂ -AR may be more important than that of β-AR in develepment of ALI. (2) The decrease of β₂ -AR mRNA expression may be one of the reasons of reduction of lung tissue β₂ -AR in ALI.
MeSH Endotoxins; Lung; Injuries;Receptor，adrenergic beta; Gene expression；Rats

受体及其信号传导系统在细胞间信息传导过程中起十分重要的作用。受体作为细胞的组分之一，并非静止不变而是处于动态平衡中。受体数量或功能的异常变化必将影响细胞自身及组织器官的功能，严重时就可引发或加重某些疾病过程^[1] 。作者既往研究发现^[2] ，内毒素(endotoxin, ET)性急性肺损伤(acute lung injury, ALI)时肺组织β受体数目减少，其在ALI发病中起一定作用。但有关ALI时肺组织β₂ 受体及其基因表达的变化研究，目前尚未见报道。本研究旨在通过静脉注射内毒素复制大鼠ALI模型，检测肺组织β和β₂ 受体及β₂ 受体mRNA含量的变化。

材料与方法

一、实验分组及处理：
51只健康成年雄性Wistar大鼠随机分4组：(1)内毒素1 h组(n=12)。(2)内毒素4 h组(n=12)。(3)内毒素6 h组(n=12)。以上3组每只大鼠均向尾静脉注入内毒素5 mg/kg,以复制ALI模型。(4)对照组(n=15)，于尾静脉注射等量生理盐水替代ET。所有动物均于设定的时点经1%戊巴比妥钠(40 mg/kg.ip)麻醉后，行颈动脉插管放血活杀。取出肺组织称重后立即取部分肺组织投入液氮中速冻，然后置-70℃待测mRNA受体测定用新鲜肺组织样品。
二、肺组织细胞膜β和β₂ 受体放射性配基结合分析：
将肺脏取出后切碎，依文献^[3] 制备肺组织细胞膜，用考马斯亮蓝法测定膜蛋白量，调配蛋白浓度为2 g/L。以[³ H]-双氢烯丙洛尔([³ H]-dihydroalprenolol,[³ H]-DHA比活性444×10¹⁰ Bq/mmol,美国DU PONT公司)为标记配基，非特异结合管加心得舒，β₂ 受体结合管加β₁ 受体特异性拮抗剂阿替洛尔(Atenolol, 美国Sigma公司)，按文献^[4] 做结合试验，绘饱和曲线，据Scatchard作图求受体Bmax和平衡解离常数K_D 。
三、肺组织β₂ 受体mRNA含量测定：
1.β₂ 受体cDNA探针的制备及标记：将载有仓鼠β₂ 受体cDNA质粒(美国DUKE大学Collins博士惠赠)经电转化导入XL-lblue菌中，扩增后碱变性法提取质粒，Hind Ⅲ酶切后，电泳洗脱法回收cDNA，其片段为1.2 kb，地高辛随机引物标记探针并定量。
2.肺组织总RNA提取：按总RNA提取试剂盒说明书进行。经紫外分光光度计测RNA OD 260/OD 280并定量。
3.斑点杂交：将纯化并定量后的β₂ 受体cDNA片段按3倍稀释法依次稀释成750，250，83.3，27.7，9.3，3.1，1.0 P g/μL浓度，杂交及定量分析依文献^[5] 方法进行。
四、肺体指数(lung body index，LBI)：

五、形态学观察：
首先观察肺脏大体病变，然后行HE染色光镜下观察。
六、数据处理：
所有数据均用本校统计教研室的统计软件进行方差分析和t检验。数据以均数±标准差(±s)表示。

结果

一、肺组织β及β₂ 受体变化：
静注ET后1、4、6 h，大鼠肺组织β受体的Bmax均显著低于对照组(P <0.01)，各ET组间差异不明显(P >0.05)β₂ 受体变化与β受体一致。二者的平衡解离常数K_D 值与对照组均无显著差异(P >0.05)(见表1)。正常肺组织β及β₂ 受体饱和曲线及Scatchard图，见图1，2。

表1 大鼠肺组织β和β₂ 受体密度和解离常数的变化
Tab 1 changes of density and affinity of β and β₂ adrenoceptor in the membrance prepared from lung of rats(±s)

**P <0.01, vs control group

Fig 1 Saturation curves of [³ H]-DHA binding to β-adrenoceptor in the membrane prepared from lung of rats in control group. TB:totol
binding, NB: nonspecific binding, B:specific binding. The inset shows a Scatchard plots of [³ H]-DHA bound using the mean data from the figure for control group. B: specific binding [³ H]-DHA(fmol/μg protein), F:free [³ H]-DHA(nmol/L).
图1 正常大鼠肺组织β-AR饱和曲线和Scatchard图

Fig 2 Saturation curves of [³ H]-DHA binding to β ² -adrenoceptor in the membrane prepared
from lung of rats in control group. The inset shows a Scatchard plots
图2 正常大鼠肺组织β₂ -AR饱和曲线和Scatchard图

二、肺组织β₂ 受体mRNA含量：
静注ET后4和6 h，大鼠肺组织β₂ 受体mRNA含量分别下降到对照组的76.4%±19.6%和52.8%±20.4%，均明显低于对照组(P <0.01)，注ET后1 h组与对照组无显著差异(98.7%±23.2%，P >0.05)。
三、LBI的变化：
LBI可粗略地反映肺水肿程度，静注ET后1 h\,4 h\,6 h大鼠LBI均显著高于对照组(P<0.01)，静注ET后4 h和6 h的LBI均显著高于1 h组(P <0.05,P <0.01)(见表2)。

表2 大鼠肺体指数的变化
Tab 2 Changes of lung body index of rats(±s)

**P <0.01, vs control group
△ P <0.05, △△ P <0.01, vs 1 h group

四、形态学改变：
ET组大鼠肺脏均有不同程度的充血、肿胀，光镜下可见肺间质、肺泡水肿及PMN浸润，并可见散在出血灶；对照组未见异常改变。

讨论

目前认为，PMN于肺内聚集，激活并释放炎性介质，从而介导肺微血管膜及肺泡上皮广泛损伤是ALI重要的发病机制之一。肺表面活性物质的合成和释放减少也参与ALI的发生发展。业已证实^[6] ，β₂ 受体激动剂不仅明显地抑制炎性细胞(PMN，嗜酸性粒细胞，肺泡巨噬)细胞活化及其于肺内聚集，抑制白细胞和内皮细胞的粘附及炎性介质的释放且能抑制微血管的通透性，增加肺泡中液体的清除及内皮细胞的屏障功能，促进Ⅱ型肺泡上皮细胞合成并分泌肺表面活性物质。实验发现^[7] ，β₂ 受体激动剂可明显减轻急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome. ARDS)患者及实验动物的通透性肺水肿。临床应用β₂ 受体激动剂减轻肺水肿的程度越明显，ARDS患者的预后也越好。β₂ 受体激动剂的作用是通过细胞膜β₂ 受体介导的，其产生的效应是由膜受体的数目和功能状态决定的^[1] 。我们既往的研究发现^[2] ，β受体数目减少在ALI发病中起一定作用。本实验结果也显示，大鼠静注ET后，肺组织β受体数目明显减少，同时还进一步证实ET性ALI大鼠肺组织β₂ 受体减少更明显。本研究结果显示，β₂ 受体占大鼠肺组织β受体的83%。注ET后6 h肺组织β和β₂ 受体分别下降到约为对照组的51%和41%，表明ET性ALI时，大鼠肺组织β受体下降主要是β₂ 受体的减少，提示β₂ 受体的变化可能与ALI关系更密切。
β受体数目减少的机制十分复杂，至今尚未完全阐明^[8] ，我们既往研究发现^[2] ，ET性ALI时，活性氧生成过多是肺组织β受体数目下降的主要因素，炎性介质，膜磷脂代谢的改变也参与了β受体的下调。本研究进一步观察到静注ET后1 h大鼠肺组织β₂ 受体mRNA含量无明显变化，4 h和6 hβ₂ 受体mRNA含量显著低于对照组，提示注射ET 1 h肺组织β₂ 受体数目的减少不是受体mRNA的减少所至，而注射ET后4 h和6 h β₂ 受体mRNA含量的减少可能是肺组β₂ 受体数目减少的原因之一。

参考文献

1 吕宝璋，田英编著.受体学概论.第1版.北京：科学出版社，1991.50～80.
2 孙耕耘，毛宝龄，吕宝璋.大鼠内毒素性肺损伤肺α₁ 和β受体的变化.中国病理生理杂志，1993，9(5)：622.
3 谢剑鸣，薛全福，王立荣.常压缺氧对大鼠肺组织β和α₁ 肾上腺素能受体数目的影响.中国病理生理杂志，1989，5(5)：261.
4 王晓芳，薛全福.常压缺氧性肺动脉高压大鼠肺组织肾上腺素能受体亚型数目的动态变化.中国病理生理杂志，1993，9(3)：342.
5 蔡文琴，王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第1版.成都四川科学出版社，1994.495～500.
6 Heible J，Bondinell W，Ruffolo R, et al. α and β adrenoceptors: From the gene to the clinic. American Chemical Society, 1995, 38(18):3 416.
7 Basran GS. Beta-2-adrenoceptor agonists as inhibitors of lung vascular permeability to radiolabelled transfer in the adult respiratory distress syndrome in man. Eur J Nucl Med, 1986, 12: 381.
8 Collins S. Recent perspective on the molecular structure and regulation of the β₂ adrenoceptor. Life Sci, 1993, 52:2 083.

1997年7月22日收稿，1998年3月3日修回

, 百拇医药

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