应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
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白桂芹, 成 军, 张树林, 刘 妍, 刘
白桂芹,成军,张树林,刘妍,刘蔚,张黎颖,张树林,通讯作者,:,摘要,目的,方法,结果,结论,.,2.4,差异表达cDNA
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参见附件(664KB，4页)。
白桂芹,成军,张树林, 刘妍,刘蔚, 张黎颖,北京地坛医院传染病研究所 北京市 100011
张树林,西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
国家自然科学基金资助,No. C03011402, No. C30070689
军队九、五科技攻关项目,No.98D063
军队回国留学人员启动基金项目,No. 98H038
军队十、五科技攻关青年基金项目,No. 01Q138
军队十、五科技攻关面上项目,No. 01MB135
通讯作者:成军,北京市100011, 北京市东城区安外大街地坛公园13号,北京地坛医院传染病研究所. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真:010-64281540
收稿日期:2005-01-10 接受日期:2005-05-25
摘要目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HBVCSTP1反式激活相关基因.
方法:以HBV CSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.
结果:成功构建人HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到100-1000 bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析，获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.
结论:应用SSH技术成功构建了HBVCSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBVCSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
白桂芹,成军,张树林, 刘妍,刘蔚, 张黎颖.应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因.世界华人消化杂志 2005;13(15):1897-1900
1 (PDF) 消减效率分析结果. 1-4: 未消减组，引物为G3PDH3’、5’，PCR循环次数分别为18、23、28、33;5-8: 消减组，引物为G3PDH3’、5’，PCR循环次数分别为18、23、28、33.
2.4 差异表达cDNA片段的扩增及克隆杂交产物经两轮PCR扩增后，菌落PCR扩增结果显示为200-1000 bp大小不等的插入片段，所获得的86个克隆中几乎均含有插入片段，这些条带可能代表差异表达的基因片段(图2).
图2 (PDF)部分克隆(E142-63)菌落PCR鉴定电泳图.
2.5 cDNA测序与同源性分析结果挑选25个克隆测序，与GenBank数据库进行初步比较.2个克隆未检索到任何对应的相似序列，可能代表了某些新基因.应用生物信息学技术对他们进行克隆分析，获得相应的全长编码基因，新基因结构及功能分析正在进行中.其余23个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(96-100%，表1).
表1 阳性克隆与GenBank同源序列比较结
| 已知的同源序列编码蛋白 | 相同克隆数 | 同源性(%) |
| 人类真核翻译延长因子1 | 2 | 100 |
| 人类热休克蛋白 | 3 | 99 |
| 人类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 | 1 | 99 |
| 人类仅在胎盘绒毛表达的mRNA | 1 | 97 |
| 人类核糖体蛋白 | 5 | 98 |
| 人类NADH 脱氢酶 | 1 | 99 |
| 人类磷蛋白质 | 1 | 99 |
| 人类肌动蛋白相关蛋白 | 1 | 100 |
| 人类主要组织相容性复合物I(MHC-I) | 2 | 100 |
| 人类细胞色素氧化酶亚单位1 | 1 | 100 |
| 人类线粒体核糖体蛋白 | 1 | 100 |
| 人类磷脂酰肌醇聚糖3 | 1 | 100 |
| 人类肌动蛋白 | 1 | 100 |
| 人类微管蛋白2 | 1 | 100 |
| 人类Axin 2 | 1 | 100 |
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