乙型肝炎病毒基因分型方法的建立及应用
【摘要】 目的 建立一种乙型肝炎病毒基因分型方法并应用于临床。方法 用基因型特异性引物PCR法检测我院门诊和住院乙型肝炎患者基因分型。结果 180例乙型肝炎患者基因分型中B型31例(17.2%)，C型139例(77.2%)，BC混合型10例(5.6%)。结论 我地区乙型肝炎患者基因分型以B型和C型为主，主要是C型，其次是B型，其他分型未出现，还有待于进一步研究。
【关键词】 乙型肝炎；病毒；基因型
近年来，国内外学者对乙型肝炎病毒(HBV)基因分型进行了大量的研究，各地区均有报道，截止至今，根据HBV全基因核苷酸序列异源性8%或S基因区核苷酸序列异源性4.2%，HBV基因型可分为A、B、C、D、E、F、G、H 8型。Naito[1]等设计了A～F六种基因型特异性引物，我们用基因特异性引物PCR技术，对鄂尔多斯市地区慢性乙型肝炎患者血清病毒进行基因分型，研究我地区乙肝病毒基因型分布的特点。
1 资料与方法
1.1 一般资料 180例血清标本均为我院2004年3月～2005年3月门诊和住院患者，其中急性肝炎(AHB)26例，慢性肝炎(CHB)128例，肝硬化(LC)23例，重症肝炎(SH)3例。诊断符合2000年西安修订的全国性病毒性肝炎诊断标准。
1.2 试剂 引物及DNA聚合酶由北京佑安医院肝病研究所提供。分子量标准SD002购自北京鼎国生物技术有限责任公司，参照片段：19325，500，400，300，200，100。
1.3 方法
1.3.1 HBV-DNA的提取 裂解液95℃加热裂解。
1.3.2 引物设计 设计外引物P和S，内引物A组和B组。(1)外引物P：5′-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3′(nt2823-2845)；S：5′-CGAACCACTGAACAAATGGC-3′(nt685-704)。(2)内引物。A组：B2F 5′-GGCTCCAGTTCCGGAACAGT-3′(nt67-86)；BA1R 5′-CTCGCGGAGATTGACGAGATGT-3′(nt113-114)；BB1R 5′-CAGGTTGGTGAGTGACTGGAGA-3′(nt324-345)；BC1R 5′-GGTCCTAGGAATCCTGATGTTG-3′(nt165-186)。B组：BD1 5′-GCCAACAAGGTAGGAGCT-3′(nt2979-2996)；BE1 5′-CACCAGAAATCCAGATTGGGACCA-3′(nt2955-2978)；BF1 5′-GCTACGGTCCAGGGTTACCA-3′(nt3032-3051)；B2R 5′-GGAGGCGGATCTGCTGGCAA-3′(nt3078-3097)。
1.3.3 HBV-DNA外引物进行PCR 反应总体积为30μl，扩增条件：95℃变性5min，然后94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，循环35次，最后72℃延伸7min。
1.3.4 HBV-DNA内引物进行套式PCR 反应总体积为30μl，扩增条件：第1次PCR：95℃变性5min，然后94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，循环20次。第2次PCR：94℃、20s，60℃、20s，72℃、30s，循环20次。
1.3.5 电泳 取扩增产物8μl，用3%琼脂糖凝胶电泳(120V，80mA,1.5h)。
2 结果
随机挑选B型、C型、BC混合型血清各2份，用HBV S基因区直接进行核苷酸序列分析方法鉴定，基因分型鉴定结果前后符合率为100%。
180例乙型肝炎病毒感染者的基因分型分布：B型31例(17.2%)，C型139例(77.2%)，BC混合型10例(5.6%)。180例乙型肝炎患者诊断分型与基因型分布，见表1。
表1 各组乙型肝炎患者病毒基因型分布情况 (略)
3 讨论
研究表明，HBV基因型与乙型肝炎的临床表现、治疗、预后等都有密切的关系[2]，目前，乙型肝炎病毒基因型的分型方法有多种，我们采用基因型特异性引物PCR法测定乙型肝炎病毒基因型，进行套式PCR，保证了同一基因型内核苷酸序列差异≤2，不同基因型间核苷酸序列差异≥3，并使不同基因型扩增产物的相对分子质量不同，在电泳后得出结果，其结果可靠，操作相对简便，可在临床和科研工作中普及，便于流行病学调查。
通过对我地区180例HBV-DNA基因分型研究，以B型和C型为主，主要是C型，这与文献[3]报道北方主要是C型一致。其次是B型，出现BC混合型可能是由于不同基因型的重复感染造成的，或者是病毒在长期免疫压力下，逃避宿主的变异积累的结果。
研究发现，鄂尔多斯市地区C型中慢性乙肝患者所占比例最高，而B型中急性肝炎患者比例高于慢性乙肝患者，在BC混合型中，肝硬化患者所占比率最高，目前许多研究提示，HBV基因型C型患者比B型患者有更严重的肝损害，且平均年龄高于B型。有关乙型肝炎病毒基因型与临床预后的关系，有待于我们进一步研究探讨。
【参考文献】
1 Huy TT,Ushijima H,Quang VX,et al.Genoeype C of hepatitis B virus can be classified into at least two subgroups.J Viral Hepat,2001,8(5):311-321.
2 邵飞，朱风群.乙型肝炎病毒基因分型的研究进展.医学综述，2005，11(3)：253-255.
3 Ohba,Miaokami M,Ohno T,et al.Relationship among genotypes of hepatitis B virus:genetic classification of HBV by use of surface genes.Virus Res,1995,39:25-34.
作者单位： 017000 内蒙古鄂尔多斯，鄂尔多斯市第二人民医院
(编辑：吴 莹), http://www.100md.com(薛宝莲 刘永清 许万良 杨建林)
【关键词】 乙型肝炎；病毒；基因型
近年来，国内外学者对乙型肝炎病毒(HBV)基因分型进行了大量的研究，各地区均有报道，截止至今，根据HBV全基因核苷酸序列异源性8%或S基因区核苷酸序列异源性4.2%，HBV基因型可分为A、B、C、D、E、F、G、H 8型。Naito[1]等设计了A～F六种基因型特异性引物，我们用基因特异性引物PCR技术，对鄂尔多斯市地区慢性乙型肝炎患者血清病毒进行基因分型，研究我地区乙肝病毒基因型分布的特点。
1 资料与方法
1.1 一般资料 180例血清标本均为我院2004年3月～2005年3月门诊和住院患者，其中急性肝炎(AHB)26例，慢性肝炎(CHB)128例，肝硬化(LC)23例，重症肝炎(SH)3例。诊断符合2000年西安修订的全国性病毒性肝炎诊断标准。
1.2 试剂 引物及DNA聚合酶由北京佑安医院肝病研究所提供。分子量标准SD002购自北京鼎国生物技术有限责任公司，参照片段：19325，500，400，300，200，100。
1.3 方法
1.3.1 HBV-DNA的提取 裂解液95℃加热裂解。
1.3.2 引物设计 设计外引物P和S，内引物A组和B组。(1)外引物P：5′-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3′(nt2823-2845)；S：5′-CGAACCACTGAACAAATGGC-3′(nt685-704)。(2)内引物。A组：B2F 5′-GGCTCCAGTTCCGGAACAGT-3′(nt67-86)；BA1R 5′-CTCGCGGAGATTGACGAGATGT-3′(nt113-114)；BB1R 5′-CAGGTTGGTGAGTGACTGGAGA-3′(nt324-345)；BC1R 5′-GGTCCTAGGAATCCTGATGTTG-3′(nt165-186)。B组：BD1 5′-GCCAACAAGGTAGGAGCT-3′(nt2979-2996)；BE1 5′-CACCAGAAATCCAGATTGGGACCA-3′(nt2955-2978)；BF1 5′-GCTACGGTCCAGGGTTACCA-3′(nt3032-3051)；B2R 5′-GGAGGCGGATCTGCTGGCAA-3′(nt3078-3097)。
1.3.3 HBV-DNA外引物进行PCR 反应总体积为30μl，扩增条件：95℃变性5min，然后94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，循环35次，最后72℃延伸7min。
1.3.4 HBV-DNA内引物进行套式PCR 反应总体积为30μl，扩增条件：第1次PCR：95℃变性5min，然后94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，循环20次。第2次PCR：94℃、20s，60℃、20s，72℃、30s，循环20次。
1.3.5 电泳 取扩增产物8μl，用3%琼脂糖凝胶电泳(120V，80mA,1.5h)。
2 结果
随机挑选B型、C型、BC混合型血清各2份，用HBV S基因区直接进行核苷酸序列分析方法鉴定，基因分型鉴定结果前后符合率为100%。
180例乙型肝炎病毒感染者的基因分型分布：B型31例(17.2%)，C型139例(77.2%)，BC混合型10例(5.6%)。180例乙型肝炎患者诊断分型与基因型分布，见表1。
表1 各组乙型肝炎患者病毒基因型分布情况 (略)
3 讨论
研究表明，HBV基因型与乙型肝炎的临床表现、治疗、预后等都有密切的关系[2]，目前，乙型肝炎病毒基因型的分型方法有多种，我们采用基因型特异性引物PCR法测定乙型肝炎病毒基因型，进行套式PCR，保证了同一基因型内核苷酸序列差异≤2，不同基因型间核苷酸序列差异≥3，并使不同基因型扩增产物的相对分子质量不同，在电泳后得出结果，其结果可靠，操作相对简便，可在临床和科研工作中普及，便于流行病学调查。
通过对我地区180例HBV-DNA基因分型研究，以B型和C型为主，主要是C型，这与文献[3]报道北方主要是C型一致。其次是B型，出现BC混合型可能是由于不同基因型的重复感染造成的，或者是病毒在长期免疫压力下，逃避宿主的变异积累的结果。
研究发现，鄂尔多斯市地区C型中慢性乙肝患者所占比例最高，而B型中急性肝炎患者比例高于慢性乙肝患者，在BC混合型中，肝硬化患者所占比率最高，目前许多研究提示，HBV基因型C型患者比B型患者有更严重的肝损害，且平均年龄高于B型。有关乙型肝炎病毒基因型与临床预后的关系，有待于我们进一步研究探讨。
【参考文献】
1 Huy TT,Ushijima H,Quang VX,et al.Genoeype C of hepatitis B virus can be classified into at least two subgroups.J Viral Hepat,2001,8(5):311-321.
2 邵飞，朱风群.乙型肝炎病毒基因分型的研究进展.医学综述，2005，11(3)：253-255.
3 Ohba,Miaokami M,Ohno T,et al.Relationship among genotypes of hepatitis B virus:genetic classification of HBV by use of surface genes.Virus Res,1995,39:25-34.
作者单位： 017000 内蒙古鄂尔多斯，鄂尔多斯市第二人民医院
(编辑：吴 莹), http://www.100md.com(薛宝莲 刘永清 许万良 杨建林)