苦味酸天狼猩红-偏振光法在皮肤科的运用
【摘要】 苦味酸天狼猩红-偏振光法是一种操作简便、经济、效果鲜明的胶原显示法，并且结合计算机成像系统可以进行定量分析。本文综述苦味酸天狼猩红-偏振光法在国内外皮肤纤维化性研究方面的进展。
【关键词】 苦味酸天狼猩红-偏振光法；胶原
【Abstract】 Picrosirius-polarization is a simple method to detect the collagens. The content and distribution of collagen were observed with polarization microscopy combined with image analysiing of dermal section stained with picrosiriusred. We would review the application of this method in cutaneous study.
【Key words】 picrosiriusred;collagen
胶原是人体皮肤组织的重要成分，老化及病变皮肤可发生不同程度的胶原改变，故胶原的定量定性分析可用于辅助诊疗和病程分期。皮肤主要含Ⅰ型和Ⅲ型胶原,常规苏木素-伊红(HE)染色、苦味酸-酸性品红(VG)染色等特殊染色能表达胶原总体的变化，但不能同时区分Ⅰ、Ⅲ型胶原，并且容易褪色，不易长久保存[1]。免疫组化染色虽能区分Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，但不能在同一切片中同时反映两种胶原(Ⅰ/Ⅲ型)的变化，不利于综合分析，而且操作繁琐，试剂较贵。
苦味酸天狼猩红-偏振光法[2](Picrosirius-Polarization，PSP)，即苦味酸天狼猩红染料胶原染色，偏光显微镜下观察。其原理基于胶原分子丰富的碱性氨基酸和因胶原蛋白平行聚合排列而具有的双折射性质。由于天狼猩红是强酸性染料，可与胶原起强烈反应，因而吸附稳定，不易褪色；同时，天狼猩红染料分子呈长形展开，在长轴方向以彼此平行的方式附着于每个胶原分子，使胶原的双折射性明显增强，因而入射的正交偏光由于双折射而发生的光干涉更明显，不同折射率表现出不同的干涉色和折射强度。Ⅰ型胶原纤维由多个原纤维粒合成，成熟、粗大，折射率强，故偏光镜下呈亮黄、橙或红色粗纤维状；Ⅲ型胶原纤维以原纤维形式存在，纤细、幼稚，折射率弱，故偏光下为细长的绿色纤维。PSP胶原显示法操作简便、经济，胶原形态和分布显示清晰，结果稳定可长期保存，同一切片中Ⅰ/Ⅲ型胶原颜色对比鲜明，易于确定其比例和综合分析，结合图像分析技术还能进行定量研究，是目前显示胶原和研究纤维性病变的较好方法。现就此法在纤维化性皮肤疾病研究方面的运用做一综述。
1 伤口与瘢痕分析
1.1 伤口愈合程度 合成胶原纤维是伤口愈合的重要环节，随着胶原逐渐成熟，胶原分子和原纤维的排列发生改变，双折射性也逐渐增强，干涉色发生变化，因此借助偏光镜可以观察伤口纤维化的程度。Berry 等[3]发现早期伤口肉芽组织中主要是纤细、淡绿、弱双折射性的Ⅲ型胶原，随着伤口成熟，Ⅰ型胶原逐渐增多而呈橙黄色，双折射增强。Szendroi等[4]也观察到在伤口愈合过程中，偏光镜下长波长的偏光颜色日益增多，胶原由早期细绿样逐渐转变为粗密的黄、橙或红色样。研究表明镜下胶原形态及颜色反映胶原成熟状态，可以辅助分析伤口愈合程度。
1.2 瘢痕研究
1.2.1 瘢痕分期 Pickering等[5]发现随着瘢痕成熟，胶原平均灰度及其比例逐渐增加，21天时胶原面积比例达80%。刘策励等[6]观察到1个月瘢痕中黄、红色较粗大的Ⅰ型胶原纤维约占整个视野的50%；3个月以上的瘢痕中绿细的Ⅲ型胶原纤维比例已降低，大量Ⅰ型胶原纤维排列紊乱；1.5年以上瘢痕中Ⅰ型胶原纤维约占95%以上，聚集成块状，部分僵硬呈竹节状，Ⅲ型胶原含量低于5%。说明在瘢痕成熟过程中Ⅰ型胶原纤维的绝对含量及比例均明显增加，而Ⅲ型胶原则逐渐减少，因此量化评估瘢痕皮损的纤维化过程可以辅助瘢痕分期。
1.2.2 病理性瘢痕观察及治疗 病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，病理上表现为细胞外基质中胶原异常增多和过度沉积。黎小间等[7]通过PSP法观察到增生性瘢痕组织中含有大量胶原纤维束，在真皮乳头层，强折光性的黄红色Ⅰ型胶原纤维呈致密的条束状，排列紊乱、纵横交错、密度不均；在真皮网状层，Ⅰ型胶原纤维呈现为近似平行排列、密度均一的纤维束。细绿的Ⅲ型胶原纤维呈疏网状散布于Ⅰ型胶原周围。结合图像分析技术可知Ⅰ型胶原占(73.95±3.22)%，Ⅲ型胶原占(22.13±3.57)%。瘢痕疙瘩与增生性瘢痕相似，但Ⅰ型胶原纤维更加粗大致密,块状聚集,构成致密的宽带状胶原纤维结构，Ⅰ、Ⅲ型胶原分别占(64.5±2.7)%和(30.7±2.6)%[8]。
病理性瘢痕的治疗是目前皮肤科及美容医学的热点，Har-Shai等[9]以PSP法观察冷冻治疗病理性瘢痕的疗效。他们以偏光镜下不同方向的红绿比例分别代表两种纤维的空间走向和相对量，结果显示：偏光镜下红绿纤维交织，治疗前红绿比例为(1.4±0.15)∶1，治疗1个月后为(1.14±0.15)∶1，治疗3个月后为(1.06±0.2)∶1。治疗前纤维有序空间方向指数1.4±0.02，治疗后指数明显升高为2.06±0.7。说明异常增生的粗大胶原在治疗后减少，纤维分布由治疗前的杂乱无序变得相对规则。治疗后瘢痕较平，胶原纤维数量上趋于正常，轴向趋于与皮肤表面平行，说明冷冻治疗瘢痕是有效的。
2 皮肤疾病的胶原分析
许多皮肤疾病，特别是纤维化性病变会出现胶原含量或性质的改变，已有研究者将PSP法运用于疾病研究。Trau等[10]发现偏光镜下结缔组织痣患者胶原均为绿色或黄绿色，而不像正常皮肤那样呈橙、黄色，证实该疾病皮肤缺乏粗大胶原束。同样，进行性系统性硬皮病患者也被观察到在疾病任何阶段胶原均呈绿色，并且胶原直径明显小于正常组[11]。皮肤弹性过度(Ehlers-Danlos综合征)临床上以皮肤松弛和过度伸长为特征，偏光镜下可见病理相符的真皮胶原明显减少，直径变短，部分胶原破碎，纤维束结构紊乱[12]。Andrade等[13]收集临床不同病程lechiguana病(增生性纤维肉芽肿性脂膜炎)患者的皮损(从14天~8个月)，用组织化学和PSP法相互验证和计算胶原含量及胶原聚集状况，发现早期的肉芽肿内以细胶原纤维为主；随病程发展，粗大的胶原纤维比例逐渐增多。以病程为自变量，胶原聚集状况为应变量，可得出一条相关曲线。上述研究说明PSP法在辅助诊断和病程分期方面有积极意义。
此外，PSP法还可以辅助鉴别诊断。局限性硬皮病与硬化性萎缩性苔藓在早期从临床和组织学上都可以鉴别，但是到后期鉴别却比较困难。但是PSP法对比观察可以发现：局限性硬皮病患者真皮乳头层和网状层的胶原纤维在疾病早晚期均呈绿色，只是紧挨表皮下的区域为橙黄色；而硬化性萎缩性苔藓患者真皮网状层胶原在疾病早晚期也均呈绿色，但是真皮乳头层胶原纤维却一直为橙色[14]。
3 美容术后疗效的观察
皮肤表面的细腻光洁程度与其真皮胶原类型、排布和形态密切相关。梁刘萍等[15]以猪为动物模型进行皮肤磨削术研究。术后皮肤细小皱纹消除,组织学上真皮浅层绿色的Ⅲ型胶原减少,红色的Ⅰ型胶原增多。可见磨削术促进胶原代谢更新，使Ⅰ型胶原增多，能消除细小皱纹，对改善皮肤的老化有一定的作用。
总之，胶原纤维是细胞外基质的重要成分和皮肤的主要结构蛋白，承担支架及特殊生理功能。研究胶原纤维的变化规律,对揭示组织修复的机制及皮肤纤维化疾病的分型分级很有益处。苦味酸天狼猩红-偏振光法操作简便、经济，胶原显示效果清晰，颜色鲜明，可综合分析，结合计算机成像系统还可对胶原定性定量，是目前研究胶原的好方法，在美容学及纤维性疾病方面的研究中起着积极的作用。
【参考文献】
1 谢美容, 王玮. 胶原纤维的天狼猩红染色法与Vangieson染色法的比较.四川解剖学杂志, 2002,10(2):128-129.
2 Junqueira LCU, Bignolas G, Brentani RR. Picrosirius staining plus polarization microscopopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histolchem J, 1979,11:447-455.
3 Berry DP, Harding KG, Stanton MR, et al. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg, 1998，102(1):124-134.
4 Szendroi M, Vajta G, Kovacs L, et al. Polarization colours of collagen fibres: a sign of collagen production activity in fibrotic processes. Acta Morphol Hung,1984, 32(1): 47-55.
5 Pickering JG, Boughner DR. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. Am J Pathol, 1991，138(5): 1225-1231.
6 刘策励, 赵雄飞. 烧伤后不同类型胶原在增生性瘢痕发生中的作用研究. 现代康复, 2001，5(5):36-37.
7 黎小间，雷涛，高建华.苦味酸天狼星红偏振光法检测增生性瘢痕组织胶原. 第一军医大学学报, 2002,22(3):217-219.
8 刘剑毅，纪淑兴，李世荣, 等. 天狼猩红偏振光法在病理性瘢痕纤维化研究中的应用. 中国临床康复,2003,7(6):905-906.
9 Har-Shai, Yaron, Amar, et al. Intralesional Cryotherapy for Enhancing the Involution of Hypertrophic Scars and Keloids. American Society of Plastic Surgeons, 2003,111(6): 1841-1852.
10 Trau H, Dayan D, Hirschberg A, et al. Connective tissue nevi collagens. Study with picrosirius red and polarizing microscopy. Am J Dermatopathol, 1991,13(4): 374-377.
11 Yamamoto N, Nishioka S, Sasai Y. Polarization microscopic investigation of collagen and acid glycosaminoglycans in the skin of progressive systemic sclerosis (PSS).Acta Histochem，1995,97(2): 195-202.
12 Junqueira LC, Roscoe JT. Educed collagen content and fibre bundle disorganization in skin biopsies of patients with Ehlers-Danlos syndrome. Histochem J, 1985,17 (11): 1197-1202.
13 Andrade GB, Riet Correa F, Montes GS, et al. Dating of fibrotic lesions by the Picrosirius-polarization method. An application using the lesions of Lechiguana (bovine focal proliferative fibrogranulomatous panniculitis). Eur-J-Histochem, 1997, 41(3): 203-209.
14 Nishioka S. Histological comparison of morphea and lichen sclerosus et atrophicus.Kurume Med J，1997, 44(2): 83-90.
15 梁刘萍, 司徒朴, 蔡湛宇. 磨削术后皮肤组织变化的实验研究.实用美容整形外科杂志，1998，9(4):175-177.
作者单位： 610041 四川成都，四川大学华西医院皮肤性病科
(编辑：苜 紫), 百拇医药(石钰 李薇 李利)
【关键词】 苦味酸天狼猩红-偏振光法；胶原
【Abstract】 Picrosirius-polarization is a simple method to detect the collagens. The content and distribution of collagen were observed with polarization microscopy combined with image analysiing of dermal section stained with picrosiriusred. We would review the application of this method in cutaneous study.
【Key words】 picrosiriusred;collagen
胶原是人体皮肤组织的重要成分，老化及病变皮肤可发生不同程度的胶原改变，故胶原的定量定性分析可用于辅助诊疗和病程分期。皮肤主要含Ⅰ型和Ⅲ型胶原,常规苏木素-伊红(HE)染色、苦味酸-酸性品红(VG)染色等特殊染色能表达胶原总体的变化，但不能同时区分Ⅰ、Ⅲ型胶原，并且容易褪色，不易长久保存[1]。免疫组化染色虽能区分Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，但不能在同一切片中同时反映两种胶原(Ⅰ/Ⅲ型)的变化，不利于综合分析，而且操作繁琐，试剂较贵。
苦味酸天狼猩红-偏振光法[2](Picrosirius-Polarization，PSP)，即苦味酸天狼猩红染料胶原染色，偏光显微镜下观察。其原理基于胶原分子丰富的碱性氨基酸和因胶原蛋白平行聚合排列而具有的双折射性质。由于天狼猩红是强酸性染料，可与胶原起强烈反应，因而吸附稳定，不易褪色；同时，天狼猩红染料分子呈长形展开，在长轴方向以彼此平行的方式附着于每个胶原分子，使胶原的双折射性明显增强，因而入射的正交偏光由于双折射而发生的光干涉更明显，不同折射率表现出不同的干涉色和折射强度。Ⅰ型胶原纤维由多个原纤维粒合成，成熟、粗大，折射率强，故偏光镜下呈亮黄、橙或红色粗纤维状；Ⅲ型胶原纤维以原纤维形式存在，纤细、幼稚，折射率弱，故偏光下为细长的绿色纤维。PSP胶原显示法操作简便、经济，胶原形态和分布显示清晰，结果稳定可长期保存，同一切片中Ⅰ/Ⅲ型胶原颜色对比鲜明，易于确定其比例和综合分析，结合图像分析技术还能进行定量研究，是目前显示胶原和研究纤维性病变的较好方法。现就此法在纤维化性皮肤疾病研究方面的运用做一综述。
1 伤口与瘢痕分析
1.1 伤口愈合程度 合成胶原纤维是伤口愈合的重要环节，随着胶原逐渐成熟，胶原分子和原纤维的排列发生改变，双折射性也逐渐增强，干涉色发生变化，因此借助偏光镜可以观察伤口纤维化的程度。Berry 等[3]发现早期伤口肉芽组织中主要是纤细、淡绿、弱双折射性的Ⅲ型胶原，随着伤口成熟，Ⅰ型胶原逐渐增多而呈橙黄色，双折射增强。Szendroi等[4]也观察到在伤口愈合过程中，偏光镜下长波长的偏光颜色日益增多，胶原由早期细绿样逐渐转变为粗密的黄、橙或红色样。研究表明镜下胶原形态及颜色反映胶原成熟状态，可以辅助分析伤口愈合程度。
1.2 瘢痕研究
1.2.1 瘢痕分期 Pickering等[5]发现随着瘢痕成熟，胶原平均灰度及其比例逐渐增加，21天时胶原面积比例达80%。刘策励等[6]观察到1个月瘢痕中黄、红色较粗大的Ⅰ型胶原纤维约占整个视野的50%；3个月以上的瘢痕中绿细的Ⅲ型胶原纤维比例已降低，大量Ⅰ型胶原纤维排列紊乱；1.5年以上瘢痕中Ⅰ型胶原纤维约占95%以上，聚集成块状，部分僵硬呈竹节状，Ⅲ型胶原含量低于5%。说明在瘢痕成熟过程中Ⅰ型胶原纤维的绝对含量及比例均明显增加，而Ⅲ型胶原则逐渐减少，因此量化评估瘢痕皮损的纤维化过程可以辅助瘢痕分期。
1.2.2 病理性瘢痕观察及治疗 病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，病理上表现为细胞外基质中胶原异常增多和过度沉积。黎小间等[7]通过PSP法观察到增生性瘢痕组织中含有大量胶原纤维束，在真皮乳头层，强折光性的黄红色Ⅰ型胶原纤维呈致密的条束状，排列紊乱、纵横交错、密度不均；在真皮网状层，Ⅰ型胶原纤维呈现为近似平行排列、密度均一的纤维束。细绿的Ⅲ型胶原纤维呈疏网状散布于Ⅰ型胶原周围。结合图像分析技术可知Ⅰ型胶原占(73.95±3.22)%，Ⅲ型胶原占(22.13±3.57)%。瘢痕疙瘩与增生性瘢痕相似，但Ⅰ型胶原纤维更加粗大致密,块状聚集,构成致密的宽带状胶原纤维结构，Ⅰ、Ⅲ型胶原分别占(64.5±2.7)%和(30.7±2.6)%[8]。
病理性瘢痕的治疗是目前皮肤科及美容医学的热点，Har-Shai等[9]以PSP法观察冷冻治疗病理性瘢痕的疗效。他们以偏光镜下不同方向的红绿比例分别代表两种纤维的空间走向和相对量，结果显示：偏光镜下红绿纤维交织，治疗前红绿比例为(1.4±0.15)∶1，治疗1个月后为(1.14±0.15)∶1，治疗3个月后为(1.06±0.2)∶1。治疗前纤维有序空间方向指数1.4±0.02，治疗后指数明显升高为2.06±0.7。说明异常增生的粗大胶原在治疗后减少，纤维分布由治疗前的杂乱无序变得相对规则。治疗后瘢痕较平，胶原纤维数量上趋于正常，轴向趋于与皮肤表面平行，说明冷冻治疗瘢痕是有效的。
2 皮肤疾病的胶原分析
许多皮肤疾病，特别是纤维化性病变会出现胶原含量或性质的改变，已有研究者将PSP法运用于疾病研究。Trau等[10]发现偏光镜下结缔组织痣患者胶原均为绿色或黄绿色，而不像正常皮肤那样呈橙、黄色，证实该疾病皮肤缺乏粗大胶原束。同样，进行性系统性硬皮病患者也被观察到在疾病任何阶段胶原均呈绿色，并且胶原直径明显小于正常组[11]。皮肤弹性过度(Ehlers-Danlos综合征)临床上以皮肤松弛和过度伸长为特征，偏光镜下可见病理相符的真皮胶原明显减少，直径变短，部分胶原破碎，纤维束结构紊乱[12]。Andrade等[13]收集临床不同病程lechiguana病(增生性纤维肉芽肿性脂膜炎)患者的皮损(从14天~8个月)，用组织化学和PSP法相互验证和计算胶原含量及胶原聚集状况，发现早期的肉芽肿内以细胶原纤维为主；随病程发展，粗大的胶原纤维比例逐渐增多。以病程为自变量，胶原聚集状况为应变量，可得出一条相关曲线。上述研究说明PSP法在辅助诊断和病程分期方面有积极意义。
此外，PSP法还可以辅助鉴别诊断。局限性硬皮病与硬化性萎缩性苔藓在早期从临床和组织学上都可以鉴别，但是到后期鉴别却比较困难。但是PSP法对比观察可以发现：局限性硬皮病患者真皮乳头层和网状层的胶原纤维在疾病早晚期均呈绿色，只是紧挨表皮下的区域为橙黄色；而硬化性萎缩性苔藓患者真皮网状层胶原在疾病早晚期也均呈绿色，但是真皮乳头层胶原纤维却一直为橙色[14]。
3 美容术后疗效的观察
皮肤表面的细腻光洁程度与其真皮胶原类型、排布和形态密切相关。梁刘萍等[15]以猪为动物模型进行皮肤磨削术研究。术后皮肤细小皱纹消除,组织学上真皮浅层绿色的Ⅲ型胶原减少,红色的Ⅰ型胶原增多。可见磨削术促进胶原代谢更新，使Ⅰ型胶原增多，能消除细小皱纹，对改善皮肤的老化有一定的作用。
总之，胶原纤维是细胞外基质的重要成分和皮肤的主要结构蛋白，承担支架及特殊生理功能。研究胶原纤维的变化规律,对揭示组织修复的机制及皮肤纤维化疾病的分型分级很有益处。苦味酸天狼猩红-偏振光法操作简便、经济，胶原显示效果清晰，颜色鲜明，可综合分析，结合计算机成像系统还可对胶原定性定量，是目前研究胶原的好方法，在美容学及纤维性疾病方面的研究中起着积极的作用。
【参考文献】
1 谢美容, 王玮. 胶原纤维的天狼猩红染色法与Vangieson染色法的比较.四川解剖学杂志, 2002,10(2):128-129.
2 Junqueira LCU, Bignolas G, Brentani RR. Picrosirius staining plus polarization microscopopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histolchem J, 1979,11:447-455.
3 Berry DP, Harding KG, Stanton MR, et al. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg, 1998，102(1):124-134.
4 Szendroi M, Vajta G, Kovacs L, et al. Polarization colours of collagen fibres: a sign of collagen production activity in fibrotic processes. Acta Morphol Hung,1984, 32(1): 47-55.
5 Pickering JG, Boughner DR. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. Am J Pathol, 1991，138(5): 1225-1231.
6 刘策励, 赵雄飞. 烧伤后不同类型胶原在增生性瘢痕发生中的作用研究. 现代康复, 2001，5(5):36-37.
7 黎小间，雷涛，高建华.苦味酸天狼星红偏振光法检测增生性瘢痕组织胶原. 第一军医大学学报, 2002,22(3):217-219.
8 刘剑毅，纪淑兴，李世荣, 等. 天狼猩红偏振光法在病理性瘢痕纤维化研究中的应用. 中国临床康复,2003,7(6):905-906.
9 Har-Shai, Yaron, Amar, et al. Intralesional Cryotherapy for Enhancing the Involution of Hypertrophic Scars and Keloids. American Society of Plastic Surgeons, 2003,111(6): 1841-1852.
10 Trau H, Dayan D, Hirschberg A, et al. Connective tissue nevi collagens. Study with picrosirius red and polarizing microscopy. Am J Dermatopathol, 1991,13(4): 374-377.
11 Yamamoto N, Nishioka S, Sasai Y. Polarization microscopic investigation of collagen and acid glycosaminoglycans in the skin of progressive systemic sclerosis (PSS).Acta Histochem，1995,97(2): 195-202.
12 Junqueira LC, Roscoe JT. Educed collagen content and fibre bundle disorganization in skin biopsies of patients with Ehlers-Danlos syndrome. Histochem J, 1985,17 (11): 1197-1202.
13 Andrade GB, Riet Correa F, Montes GS, et al. Dating of fibrotic lesions by the Picrosirius-polarization method. An application using the lesions of Lechiguana (bovine focal proliferative fibrogranulomatous panniculitis). Eur-J-Histochem, 1997, 41(3): 203-209.
14 Nishioka S. Histological comparison of morphea and lichen sclerosus et atrophicus.Kurume Med J，1997, 44(2): 83-90.
15 梁刘萍, 司徒朴, 蔡湛宇. 磨削术后皮肤组织变化的实验研究.实用美容整形外科杂志，1998，9(4):175-177.
作者单位： 610041 四川成都，四川大学华西医院皮肤性病科
(编辑：苜 紫), 百拇医药(石钰 李薇 李利)