同一膀胱癌的三个亚细胞株和BIU-87膀胱癌细胞株的化疗药物敏感性研究
http://www.100md.com
林蓉. 李旭. 陈葳.
参见附件(82kb)。
作者：林蓉 李旭 陈葳
单位：(西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心 西安 710061)
关键词：膀胱癌；细胞株；肿瘤药敏
西安医科大学学报000115摘要 用未经化疗的同一膀胱癌手术标本建立的三株膀胱 癌细胞株(BLZ211、BLS211、BLX211)和人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87进行了氟尿啶啶( 5-Fu)、顺氯氨铂(CDDP)、和长春新碱(VCR)的敏感性试验。结果表明：四株膀胱癌细胞株 对这三种化疗药物的敏感性存在差异。当药物浓度分别为其临床用量的计算值时，BLZ211细 胞株对5-Fu高度敏感，与其它三株细胞的敏感性存在显著差异(P<0.05)；四株细胞对C DDP均敏感；对VCR四株细胞均耐药。提示：对化疗敏感性的差异不仅存在于不同的肿瘤病人 ，而且也存在同一肿瘤标本的不同细胞群体中。因此，化疗前进行药敏试验，实行用药个体 化对提高疗效有重要作用。
中图分类号 R73-36+1 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01 -0039-03
Chemosensitivity testing of three novel bladder transitional cell car c inoma lines derived from an untreated patient and BIU-87 cell line
Lin Rong, Li Xu, Chen Wei
(Center of Molecular Biology, First Affiliated Hospital,Xian Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT The cytotoxicity of the cisplatin,vincristine and 5 -fluorouracil on the three sub-clonal human bladder transitional cell carcinom a cell lines (BLZ211,BLS211 and BLX211) derived from an untreated patient and BIU - 87 bladder cancer cell line was evaluated using the MTT assay.4 lines showed dif fe rent sensitivities to the 3 agents:when the concentrations of the drugs were equ al to the concentration calculated in vivo.BLZ211 cells were more sensitive than t he other lines to 5-Fu and the differences were statistically significant (P <0.05)，all 4 cell lines were sensitive to CDDP and were not sensitive to VCE. Our results suggest that difference of chemosensitivity not only exists in bladd er cancer patients but also occurs in the cell subpopulations from the same pat i ent.The drug sensitivity testing of the clinical samples may have an important e ffect in chemotherapy.
KEY WORDS bladder transitional cell carcinoma cell line chemos ensitity
膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其中移行上皮癌占94%，临床上除用手术治疗外，膀胱 内灌注化疗药物已成为主要治疗方法。因此，建立合适细胞株，筛选膀胱癌敏感药物，在指 导临床化疗和筛选新抗癌药物方面具有重要意义。本实验对本中心自建的三株来源于同一膀 胱癌病人手术标本的膀胱移行细胞癌细胞及人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87进行了三种化 疗药物敏感性实验研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料与药物 人膀胱移行细胞癌BLZ211、BLS211、B LX211由本中心建立[1]，肿瘤组织来源我院泌尿外科手术标本，病理诊断为膀胱 多 发性乳头状移行细胞癌Ⅱ级。人膀胱移行细胞癌BIU-87细胞，来源于人膀胱乳头移行上皮 癌[2]。长春新碱(VCR，上海华联制药公司)，氟尿啶啶(5-Fu,上海旭东海普药业 有限公司)，顺氯氨铂(CDDP，山东齐鲁制药厂)。根据临床化疗用药剂量，依公式C(μg/m l)= 5D(C为试验浓度计算值，D为临床化疗剂量，单位mg*kg-1*d-1)计算试 验 浓度[3]，以此浓度为基础，稀释或浓缩，作为试验药物的浓度等级。临用前用含 新生小牛血清的RPMI1640培养液配制成所需浓度。四甲基偶氮唑盐(MTT)为SIGMA公司产品， 用生理盐水配成5g/L的溶液，60℃水浴下溶解完全。 1.2 细胞培养 将BLZ211、BLS211、BLX211及BIU -87细胞培养于10%新生小牛血清的RPMI 1640 培养液中，3～4d 以0.25%胰酶消化，制备成细胞悬液，接种于96孔培养板中。
1.3 体外实验
1.3.1 细胞形态学观察 取指数生长期细胞，按2×10 4/孔接种到96孔平底培养板，设空白对照组，每种药物设4个浓度，实验及对照均设4个 平行样，置CO2培养箱37℃培养，24h后加入待试药物，相差显微镜观察细胞形态学变化。
1.3.2 MTT比色法 各实验及对照组细胞培养48h后，每 孔加5g/L MTT20μl，继续培养4h后，将培养板2000r/min离心10min，弃上清液，每孔加入1 00μl 二甲基亚砜(DMSO)，振荡直至MTT还原产物甲月 赞 完全溶解，用Σ960全自动酶标仪检测各孔在570nm的光密度值(OD)，并求出各药物浓度的相 对抑制率[4]：IR=(1-加药组OD570/对照组OD570)×100%。敏感性判定：IR>50%为 高度敏感，30%
2 结 果
2.1 细胞形态学变化 BLZ211、BLS211、BLX211及BIU- 87细胞接种后贴壁生长，24h镜下观察，BIU-87大部分细胞呈纺锤形或三角形，其余三株细 胞呈上皮样，细胞形态和大小有差异，多呈圆形及三角形。5-Fu、CDDP在浓度为临床化疗 用量的计算值时即100μg/ml,4mg/ml，细胞形态发生改变，部分细胞形态变得不规则，贴壁 能力降低，呈漂浮生长趋势，用台盼蓝染色观察发现细胞死亡增多。以上效应随药物浓度升 高及作用时间延长变化而更为显著，48h后，可见部分细胞崩解成碎片。
2.2 顺氯氨铂对不同膀胱癌细胞株的作用 图1示，不同 浓度CDDP作用于BLZ211、BLS211、BLX211及BIU-87后对癌细胞生长的剂量-效应曲线。抑 制 率随浓度增加而增高，有明显剂量依赖性。当实验药物浓度为临床用量的计算值时，对各种 瘤细胞株的抑制率均>40%,为敏感，且对四株细胞的抑制率无显著性差异(P>0.05)。
2.3 5-Fu对不同人膀胱癌细胞株的影响 5-Fu作用于 几种细胞后对癌细胞的杀伤效应曲线见图2。随着5-Fu浓度升高，对肿瘤细胞生长的抑制作 用不断增大，在各不同浓度，5-Fu对细胞株BLZ211的抑制率均高于其余细胞。5-Fu在100 μg/ml即相当临床化疗用量的计量值时，对BLZ211的抑制率>50%，为高度敏感，而对其余三 株细胞抑制率<30%,说明对5-Fu不敏感，同时5-Fu对BIU-87、BLS211、BLX211与BLZ211的 抑制率有显著性差异(P<0.05)，而BIU-87，BLZ211，BLX211之间抑制率无差异(P> 0.05)。
图1 CDDP剂量对BLZ211、BLS211、BLX211及BIU-87细胞生长的抑制作用
图2 5-Fu剂量对不同癌细胞生长的抑制作用
2.4 长春新碱对不同人膀胱细胞株的作用 图3为 VCR作用于不同细胞后的结果。VCR在1μg/ml即为临床化疗用量计算值时，对各细胞抑制率 均<30%；当浓度为计算值3倍时，BLZ211、BIU-87抑制率>30%，为敏感；当浓度为计算值5 倍 时，BLZ211、BIU-87抑制率>50%，为高度敏感，BLS211、BLX211抑制率>30%，为敏感。
图3 VCR剂量对不同癌细胞生长的抑制作用
3 讨 论
采用肿瘤细胞体外药敏试验可以确定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性和耐受情况，从而有针对 性地选择有效的化疗药物，提高疗效。我们研究了5-Fu，CDDP和VCR对新建人膀胱癌细胞系 BLZ211、BLX211、BLS211和人膀胱癌细胞株BIU-87的毒性作用，发现四株人膀胱癌细胞株 对三种化疗药物敏感性存在差异。当实验药物浓度为临床用量的计算值时，细胞株BLZ211对 5 -Fu高度敏感；BLZ211、BLS211、BLX211及BIU-87对CDDP均敏感；而四株细胞株对VCR耐药 。说明同一类型肿瘤对不同化疗药物敏感性不同，即使来源于同一种肿瘤的不同的细胞群体 对同一化疗药物敏感性也不同。
膀胱癌是异质性明显的恶性肿瘤，有着不同的遗传物质改变。肿瘤细胞对化疗药物敏感性差 异可能就是由于肿瘤细胞的遗传异质性造成的。肿瘤主质细胞不是由完全相同的一群细胞组 成，化疗药物只能杀死那些对其敏感性高的细胞。在本实验中，当5-Fu为100μg/ml时，对 BLZ211与BIU-87抑制作用存在明显差异，说明同一肿瘤类型的不同个体，肿瘤对同一药物 也并非同样敏感；在同等剂量下，BLZ211与BLX211、BLS211对5-Fu敏感性存在差异，提示 同一肿瘤所有细胞对同一药物的敏感性也完全不同。
我们所使用的四株膀胱癌细胞株有着各自独特的染色体改变。BIU-87细胞的染色体分布从 亚三倍体至超五倍体，BLZ211、BLX211及BLS211细胞都是克隆化的细胞株，染色体众数在三 倍体左右，三株细胞株中每个核型都缺少一条9号染色体，另一条9号发生了臂间倒位，保留 了膀胱癌染色体畸变的大部分特点。但是BLZ211细胞有11p21和Sq21的改变，而BLX211和BLS 211细胞存在6q21→pter的缺失[5]。BLZ211、BLX211和BLS211细胞染色体继发改 变不同是否与它们之间对化疗药物敏感性差异有关，有待进一步证实。
我们发现同一类型的不同肿瘤之间以及同一肿瘤的各亚系细胞对药物的敏感性十分不同。因 此，在临床化疗中应遵循治疗的个体化原则，对病人肿瘤进行化疗药物敏感性试验，选择用 药。同时，建立不同类型膀胱癌细胞株，寻找不同组织学类型，分化程度及染色体改变的肿 瘤细胞与化疗药物敏感程度的相关性，也能为肿瘤患者用药个体化提供客观依据。
参考文献
1.李旭，陈葳，阎春芳等.人膀胱移行细胞癌系BLZ211的建立和生 物学特性[J].中华泌尿外科杂志，1997；18(6)∶328
2.俞莉章，黄亚丽，杨晨等.人体膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87的建立及生 物学特性[J].中华泌尿外科杂志，1989；10(3)∶131
3.刘春选，戴刚，张祥生等.人骨肉瘤细胞药敏试验条件的筛选[J].中华肿瘤 杂志，1996；18(6)∶445
4.马玉彦，王波，刘理等.MTT法检测人实体瘤化疗敏感性的临床应用研究[J]. 实用肿瘤杂志，1996；10(4)∶9
5.阎春芳，李旭，陈葳.三株新建人膀胱癌细胞系染色体畸变特性[J].西安 医科大学学报，1997；18(4)∶426
(1999-05-07收稿 1999-07-06修回)
作者：林蓉 李旭 陈葳
单位：(西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心 西安 710061)
关键词：膀胱癌；细胞株；肿瘤药敏
西安医科大学学报000115摘要 用未经化疗的同一膀胱癌手术标本建立的三株膀胱 癌细胞株(BLZ211、BLS211、BLX211)和人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87进行了氟尿啶啶( 5-Fu)、顺氯氨铂(CDDP)、和长春新碱(VCR)的敏感性试验。结果表明：四株膀胱癌细胞株 对这三种化疗药物的敏感性存在差异。当药物浓度分别为其临床用量的计算值时，BLZ211细 胞株对5-Fu高度敏感，与其它三株细胞的敏感性存在显著差异(P<0.05)；四株细胞对C DDP均敏感；对VCR四株细胞均耐药。提示：对化疗敏感性的差异不仅存在于不同的肿瘤病人 ，而且也存在同一肿瘤标本的不同细胞群体中。因此，化疗前进行药敏试验，实行用药个体 化对提高疗效有重要作用。
中图分类号 R73-36+1 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01 -0039-03
Chemosensitivity testing of three novel bladder transitional cell car c inoma lines derived from an untreated patient and BIU-87 cell line
Lin Rong, Li Xu, Chen Wei
(Center of Molecular Biology, First Affiliated Hospital,Xian Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT The cytotoxicity of the cisplatin,vincristine and 5 -fluorouracil on the three sub-clonal human bladder transitional cell carcinom a cell lines (BLZ211,BLS211 and BLX211) derived from an untreated patient and BIU - 87 bladder cancer cell line was evaluated using the MTT assay.4 lines showed dif fe rent sensitivities to the 3 agents:when the concentrations of the drugs were equ al to the concentration calculated in vivo.BLZ211 cells were more sensitive than t he other lines to 5-Fu and the differences were statistically significant (P <0.05)，all 4 cell lines were sensitive to CDDP and were not sensitive to VCE. Our results suggest that difference of chemosensitivity not only exists in bladd er cancer patients but also occurs in the cell subpopulations from the same pat i ent.The drug sensitivity testing of the clinical samples may have an important e ffect in chemotherapy.
KEY WORDS bladder transitional cell carcinoma cell line chemos ensitity
膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其中移行上皮癌占94%，临床上除用手术治疗外，膀胱 内灌注化疗药物已成为主要治疗方法。因此，建立合适细胞株，筛选膀胱癌敏感药物，在指 导临床化疗和筛选新抗癌药物方面具有重要意义。本实验对本中心自建的三株来源于同一膀 胱癌病人手术标本的膀胱移行细胞癌细胞及人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87进行了三种化 疗药物敏感性实验研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料与药物 人膀胱移行细胞癌BLZ211、BLS211、B LX211由本中心建立[1]，肿瘤组织来源我院泌尿外科手术标本，病理诊断为膀胱 多 发性乳头状移行细胞癌Ⅱ级。人膀胱移行细胞癌BIU-87细胞，来源于人膀胱乳头移行上皮 癌[2]。长春新碱(VCR，上海华联制药公司)，氟尿啶啶(5-Fu,上海旭东海普药业 有限公司)，顺氯氨铂(CDDP，山东齐鲁制药厂)。根据临床化疗用药剂量，依公式C(μg/m l)= 5D(C为试验浓度计算值，D为临床化疗剂量，单位mg*kg-1*d-1)计算试 验 浓度[3]，以此浓度为基础，稀释或浓缩，作为试验药物的浓度等级。临用前用含 新生小牛血清的RPMI1640培养液配制成所需浓度。四甲基偶氮唑盐(MTT)为SIGMA公司产品， 用生理盐水配成5g/L的溶液，60℃水浴下溶解完全。 1.2 细胞培养 将BLZ211、BLS211、BLX211及BIU -87细胞培养于10%新生小牛血清的RPMI 1640 培养液中，3～4d 以0.25%胰酶消化，制备成细胞悬液，接种于96孔培养板中。
1.3 体外实验
1.3.1 细胞形态学观察 取指数生长期细胞，按2×10 4/孔接种到96孔平底培养板，设空白对照组，每种药物设4个浓度，实验及对照均设4个 平行样，置CO2培养箱37℃培养，24h后加入待试药物，相差显微镜观察细胞形态学变化。
1.3.2 MTT比色法 各实验及对照组细胞培养48h后，每 孔加5g/L MTT20μl，继续培养4h后，将培养板2000r/min离心10min，弃上清液，每孔加入1 00μl 二甲基亚砜(DMSO)，振荡直至MTT还原产物甲月 赞 完全溶解，用Σ960全自动酶标仪检测各孔在570nm的光密度值(OD)，并求出各药物浓度的相 对抑制率[4]：IR=(1-加药组OD570/对照组OD570)×100%。敏感性判定：IR>50%为 高度敏感，30%
2 结 果
2.1 细胞形态学变化 BLZ211、BLS211、BLX211及BIU- 87细胞接种后贴壁生长，24h镜下观察，BIU-87大部分细胞呈纺锤形或三角形，其余三株细 胞呈上皮样，细胞形态和大小有差异，多呈圆形及三角形。5-Fu、CDDP在浓度为临床化疗 用量的计算值时即100μg/ml,4mg/ml，细胞形态发生改变，部分细胞形态变得不规则，贴壁 能力降低，呈漂浮生长趋势，用台盼蓝染色观察发现细胞死亡增多。以上效应随药物浓度升 高及作用时间延长变化而更为显著，48h后，可见部分细胞崩解成碎片。
2.2 顺氯氨铂对不同膀胱癌细胞株的作用 图1示，不同 浓度CDDP作用于BLZ211、BLS211、BLX211及BIU-87后对癌细胞生长的剂量-效应曲线。抑 制 率随浓度增加而增高，有明显剂量依赖性。当实验药物浓度为临床用量的计算值时，对各种 瘤细胞株的抑制率均>40%,为敏感，且对四株细胞的抑制率无显著性差异(P>0.05)。
2.3 5-Fu对不同人膀胱癌细胞株的影响 5-Fu作用于 几种细胞后对癌细胞的杀伤效应曲线见图2。随着5-Fu浓度升高，对肿瘤细胞生长的抑制作 用不断增大，在各不同浓度，5-Fu对细胞株BLZ211的抑制率均高于其余细胞。5-Fu在100 μg/ml即相当临床化疗用量的计量值时，对BLZ211的抑制率>50%，为高度敏感，而对其余三 株细胞抑制率<30%,说明对5-Fu不敏感，同时5-Fu对BIU-87、BLS211、BLX211与BLZ211的 抑制率有显著性差异(P<0.05)，而BIU-87，BLZ211，BLX211之间抑制率无差异(P> 0.05)。
图1 CDDP剂量对BLZ211、BLS211、BLX211及BIU-87细胞生长的抑制作用
图2 5-Fu剂量对不同癌细胞生长的抑制作用
2.4 长春新碱对不同人膀胱细胞株的作用 图3为 VCR作用于不同细胞后的结果。VCR在1μg/ml即为临床化疗用量计算值时，对各细胞抑制率 均<30%；当浓度为计算值3倍时，BLZ211、BIU-87抑制率>30%，为敏感；当浓度为计算值5 倍 时，BLZ211、BIU-87抑制率>50%，为高度敏感，BLS211、BLX211抑制率>30%，为敏感。
图3 VCR剂量对不同癌细胞生长的抑制作用
3 讨 论
采用肿瘤细胞体外药敏试验可以确定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性和耐受情况，从而有针对 性地选择有效的化疗药物，提高疗效。我们研究了5-Fu，CDDP和VCR对新建人膀胱癌细胞系 BLZ211、BLX211、BLS211和人膀胱癌细胞株BIU-87的毒性作用，发现四株人膀胱癌细胞株 对三种化疗药物敏感性存在差异。当实验药物浓度为临床用量的计算值时，细胞株BLZ211对 5 -Fu高度敏感；BLZ211、BLS211、BLX211及BIU-87对CDDP均敏感；而四株细胞株对VCR耐药 。说明同一类型肿瘤对不同化疗药物敏感性不同，即使来源于同一种肿瘤的不同的细胞群体 对同一化疗药物敏感性也不同。
膀胱癌是异质性明显的恶性肿瘤，有着不同的遗传物质改变。肿瘤细胞对化疗药物敏感性差 异可能就是由于肿瘤细胞的遗传异质性造成的。肿瘤主质细胞不是由完全相同的一群细胞组 成，化疗药物只能杀死那些对其敏感性高的细胞。在本实验中，当5-Fu为100μg/ml时，对 BLZ211与BIU-87抑制作用存在明显差异，说明同一肿瘤类型的不同个体，肿瘤对同一药物 也并非同样敏感；在同等剂量下，BLZ211与BLX211、BLS211对5-Fu敏感性存在差异，提示 同一肿瘤所有细胞对同一药物的敏感性也完全不同。
我们所使用的四株膀胱癌细胞株有着各自独特的染色体改变。BIU-87细胞的染色体分布从 亚三倍体至超五倍体，BLZ211、BLX211及BLS211细胞都是克隆化的细胞株，染色体众数在三 倍体左右，三株细胞株中每个核型都缺少一条9号染色体，另一条9号发生了臂间倒位，保留 了膀胱癌染色体畸变的大部分特点。但是BLZ211细胞有11p21和Sq21的改变，而BLX211和BLS 211细胞存在6q21→pter的缺失[5]。BLZ211、BLX211和BLS211细胞染色体继发改 变不同是否与它们之间对化疗药物敏感性差异有关，有待进一步证实。
我们发现同一类型的不同肿瘤之间以及同一肿瘤的各亚系细胞对药物的敏感性十分不同。因 此，在临床化疗中应遵循治疗的个体化原则，对病人肿瘤进行化疗药物敏感性试验，选择用 药。同时，建立不同类型膀胱癌细胞株，寻找不同组织学类型，分化程度及染色体改变的肿 瘤细胞与化疗药物敏感程度的相关性，也能为肿瘤患者用药个体化提供客观依据。
参考文献
1.李旭，陈葳，阎春芳等.人膀胱移行细胞癌系BLZ211的建立和生 物学特性[J].中华泌尿外科杂志，1997；18(6)∶328
2.俞莉章，黄亚丽，杨晨等.人体膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87的建立及生 物学特性[J].中华泌尿外科杂志，1989；10(3)∶131
3.刘春选，戴刚，张祥生等.人骨肉瘤细胞药敏试验条件的筛选[J].中华肿瘤 杂志，1996；18(6)∶445
4.马玉彦，王波，刘理等.MTT法检测人实体瘤化疗敏感性的临床应用研究[J]. 实用肿瘤杂志，1996；10(4)∶9
5.阎春芳，李旭，陈葳.三株新建人膀胱癌细胞系染色体畸变特性[J].西安 医科大学学报，1997；18(4)∶426
(1999-05-07收稿 1999-07-06修回)
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