抗哇巴因多克隆抗体的制备及免疫周期和剂量的研究
http://www.100md.com
于汶. 葛蘅. 吕卓人. 袁育康.
参见附件(173kb)。
作者：于汶 葛蘅 吕卓人 袁育康
单位：于汶 葛蘅 吕卓人(西安医科大学第一临床医学院心内科 西安 710061)；袁育康(西安医科大学免疫教研室)
关键词：哇巴因；抗体；免疫
西安医科大学学报000126摘要 制备抗哇巴因多克隆抗体，探讨最佳的免疫周期及 免疫剂量。应用哇巴因(ouabain)-牛血清白蛋白(BSA)结合物为抗原免疫家兔，每周从 兔 耳缘静脉采血，监测哇巴因特异抗体的产生；以0.25mg/次、1mg/次、1.75mg/次、2mg/次 四 种不同免疫剂量进行最佳免疫剂量的研究。5个月后颈动脉取血，进行抗体效价、亲和力及 特异性的检测。结果显示免疫间隔为6周、免疫剂量为1.75mg/次时可以获得高效价、高亲 和力和高特异性的哇巴因抗血清。
中图分类号 R392.11 文献标识码 B
文章编号 0258-0659(2000)01-00 66-03
Study on the production of polyclonal antiouabain antibody
Yu Wen,Ge Heng, Lü Zhuoren et al
(Dept.of Cardiovascular Internal Medi cine, First Affiliated Hospital,Xian Medical University， Xi′an 710061,China)
ABSTRACT This study described the preparation of polyclonal an ti-ouabain antibody.Rabbits were immunized with bovine serum albumin (BSA)-oua bain conjugates in 4 different doses of 0.25mg,1.0mg,1.75mg,and 2mg once immun iz ation.The effects of the period of immunization (2weeks, 4 weeks and 6 weeks)on the production of antibody were also had been studied.The t iter of antibody was measur ed once a week.The results have showed that the anti-ouabain antibody was of hi ght titer, high affinity and high specificity for ouabain when the dose of BSA- ouabain conjugates we used to immunize rabbits was 1.75mg and the period of immu nization was 6 weeks.
KEY WORDS ouabain antibody immunize
内源性哇巴因(Endogenous ouabain, EO)是新近发现的由肾上腺皮质球状带所分泌的一种新 的类固醇激素[1]，具有抑制对哇巴因敏感的钠泵活性的生物学特性，用高效液相 色谱分析及其他生化检测方法，无法同哇巴因相区别[2]。EO在正常人体内含量甚 微，用普通检验学方法难以检测出来。无灵敏、特异和标准的检测方法已成为EO研究中的重 要 障碍，成为深入研究EO的“瓶颈”问题。为此，本研究旨在制备抗哇巴因多克隆抗体，并探 讨免疫周期和剂量，以能获得高效价、高亲和力和高特异性的抗哇巴因多克隆抗体，这对建 立EO的免疫检测方法将具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 动物分组
1.1.1 免疫周期分组 14只雄性健康家兔， 年龄均为 4～5月，体重2～2.5kg，随机分为3组：①免疫间隔为2周，n=4;②免疫间隔为4周， n=4;③免疫间隔为6周，n=6。实验过程中3组的饲养、生活条件完全相同，免疫剂量 均为1mg/次。
1.1.2 免疫剂量分组 16只雄性健康家兔，年龄均为4 ～ 5月，体重2～2.5kg，随机分为4组：①免疫剂量为0.25mg/次，n=4；②免疫剂量为1 mg/次，n=4；③免疫剂量为1.75mg/次，n=4；④免疫剂量为2.5mg/ 次，n=5。实验过程中4组的饲养、生活条件完全相同，免疫间隔均为6周。
1.2 方法
1.2.1 哇巴因-BSA结合物的合成[3] 称取 哇巴 因溶于5ml蒸馏水中，滴加入2.5ml新配制的高碘酸钠，进行氧化反应。然后加入含2μmol 牛血清白蛋白(BSA)溶液中，室温下搅拌，加入硼氢化钠0.3g和等 体积的硫酸氨溶液，离心后取沉淀物溶于5ml 0.15mol的碳酸氢钠中，装入透析袋， 透析60h后分装。
1.2.2 哇巴因-BSA结合物的检测[3] Fo lin-酚法检测哇巴因-BSA结合物中蛋白质含量，并用高效液相色谱分析，计算哇巴 因与BSA的克分子结合率。
1.2.3 免疫程序及监测 初次免疫原为哇巴因-BSA与 等量的弗氏完全佐剂的混合物，首次剂量加倍，常规碘酒、酒精消毒颈背部皮肤后，皮下 10点注射；随后加强免疫的抗原为哇巴因-BSA与等量的弗氏不完全佐剂混合而成，按每 组的不同免疫间隔时间及免疫剂量给各组家兔进行加强免疫，每周从兔耳缘静脉取血1ml监 测抗哇巴因抗体产生情况。末次免疫后，当抗体效价达到一定程度不再增加或有下降趋势时 ，从颈动脉放血，无菌条件下分离血清，保存于-70℃低温冰箱内。
1.2.4 抗哇巴因抗体效价测定[4] 用酶联免 疫吸附法检测。用含10mg/L的哇巴因-卵清蛋白100μl/孔包被微滴板及封闭洗板后，加入 不同稀释倍数的抗体血清，37℃下静置1h；再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔血清1 00μl/孔，1h后加底物显色，测定效价。
1.2.5 抗体的亲和常数测定 参照Muller方法[5 ]测定。
式中IT为致哇巴因-HRP与包被抗体结合达50%抑制时哇巴因标准物的摩尔浓度，Tt为 此 时哇巴因-HRP中的哇巴因的摩尔浓度，b为无哇巴因抑制物时结合于抗体上的哇巴因-H PR与总哇巴因-HPR浓度之比。
1.2.6 抗体的特异性测定[6] 测定具有同哇 巴 因结构相类似的几种环戊烷多氢菲结构的类固醇或药物与抗哇巴因多克隆抗体的交叉反应， 其反应率为X/Y，以%表示。X：导致抗哇巴因抗体同包被的哇巴因抗原产生50%抑制的哇巴因 摩尔浓度；Y：导致同样现象的相应药物的小分子摩尔浓度。其中，哇巴因为半抗原。
2 结 果
2.1 抗血清效价 2周、4周、6周三组抗哇巴因抗血清平均效价 分别为1∶5×104、1∶2×105、1∶5×105。免疫剂量为0.25mg、1.0mg、1.75mg、 2.5mg 4个剂量组家兔得到的抗哇巴因抗血清平均效价分别为1∶1×105、1∶2×105、 1∶5×105、1∶2×105。
2.2 抗体的特异性 与地高辛交叉反应率为5.4%，与肾 素、去甲肾上腺素、安体舒通、可的松、强的松、孕酮及甲基睾丸酮等临床常用的小分子药 物与三组哇巴因抗血清的交叉反应，均小于0.01%。
2.3 抗血清的亲和常数 2周、4周、6周3组抗血清的平 均亲和常数分别为(2.4±0.4)×109、(4.8±0.3)×109、(4.7±0.5)×109；0 .25mg、1.0mg、1.75mg、2.5mg 4个剂量组抗血清的平均亲和常数分别为(5.02±0.2)×1 09、(4.85±0.5)×109、(4.39±0.8)×109、(3.12±0.4)×109。
2.4 不同免疫周期对特异性哇巴因抗体产生的影响 2周 组家兔在接受免疫10周后，即第5次免疫后抗体不再上升，28周后抗体效价为1∶5×10 4。4周组家兔每次免疫时期均为抗体上升阶段，28周后抗体效价为1∶2×105，但仍 呈上升趋势。6周组在免疫后5～6周时抗体效价不再上升，此后加强免疫，抗体水平迅速 升 高，28周后抗体效价达1∶5×105，其抗血清具有高特异性及高亲和力，提示免疫间隔 为6周较宜。
2.5 不同免疫剂量对抗体产生的影响 应用于免疫动物 的抗原量，在一定范围内抗原剂量越大产生的免疫应答越强，免疫效果也越好。本实验结果 显示制备抗哇巴因多克隆抗体的最适免疫剂量为1.75mg/次。
3 讨 论
内源性哇巴因(EO)是肾上腺皮质所分泌的一种新的类固醇激素[1]，具有重 要的生理和病理意义。大量的证据表明，EO是高血压发病的重要因素之一，参与了高血压的 形成[7]。过去人们对EO的检测方法主要可分为两类：一类是生物学活性测定法 [8]，如测定其与3H-哇巴因竞争性地同钠泵结合率，抑制钠泵活性的 程度 及对红细胞摄取86Rb的抑制率，但由于存在放射性污染、检测操作复杂，且所需试 剂价格昂贵，难于在临床推广普及。另一类是免疫学活性测定，如地高辛放免法[9 ] ，利用地高辛与哇巴因的交叉免疫反应进行检测。但因体内哇巴因含量低，市场上的地高 辛免疫测定试剂盒无法准确检测，更因为地高辛与哇巴因的分子结构不同 ，应用地高辛抗体检测哇巴因特异性差，所得结果不可靠而逐渐被淘汰。因此，制备抗哇巴 因多克隆抗体，建立特异性高且易于推广的检测方法无疑是该领域研究的关键问题之一。
多克隆抗体制备的影响因素主要为：免疫原性及其分子量、免疫对象、免疫原的剂量、免疫 途径和免疫周期。为获得高效价、高亲和力和高特异性的抗哇巴因多克隆抗体，本实验制备 了BSA与哇巴因的结合物为免疫原，采用颈、背部皮下多点注射，免疫家兔，并分组探讨研 究最适免疫周期和剂量。
因家兔对抗原的反应性好，容易产生高亲和力的抗体，且价格便宜，大小适中，故本实验的 免疫对象采用年龄为4～5月，体重2～2.5kg的健康家兔。哇巴因是一种小分子多肽，单 独不能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，需与蛋白结合成为完全抗原，本实验以牛血清白 蛋 白(BSA)作为载体，制备BSA与哇巴因的结合物免疫家兔。抗体产生的一般规律是初次反应、 再次反应和回忆反应的动态过程。动物经过第一次特定免疫后，经一定潜伏期(细胞增殖、 分化)才在血液中出现抗体。先是IgM，随后出现IgG，初次反应所产生的抗体量一般不多， 效价较低，持续时间也较短。当第二次相同抗原注射后，由于抗体的一部分与再次注入的抗 原结合所致原有抗体量的降低，随后IgG型抗体迅速大量增加，可比初次反应产生的量多几 倍到几十倍。由抗原刺激而产生抗体经过一定时间后可以逐渐消失，此时若再次接触抗原可 使已消失的抗体迅速上升(回忆反应)，由此而产生的抗体特异性好、效价高。
免疫动物的程序一般为第一次加强免疫与初次免疫间隔2～4周左右，而且此后每次加强免 疫的间隔也同样为2～4周左右，故本实验分别选择2周、4周、6周 3组不同免疫周期进行免 疫 ，以寻求较佳免疫时机。从抗哇巴因特异性抗体产生的免疫应答模式可以看出，2周组家 兔在接受免疫10周后，即第5次免疫后抗体不再上升，28周后抗体效价为1∶5×104， 可能是由于免疫间隔太短，大剂量的抗原注入动物体内，产生了特异性的无应答状态， 即免疫耐受；4周组家兔每次免疫时期均为抗体上升阶段，28周后抗体效价为1∶2×105 ， 但仍呈上升趋势。而从免疫间隔为6周组的免疫应答模式可以看出，在免疫后5～6周时抗体 效价不再上升，此后加强免疫，抗体水平的升高更为迅速，28周后查抗体效价达1∶5×10 5，其抗血清具有高特异性及高亲和力，提示较佳免疫间隔为6周。
至于应用于免疫动物的抗原量，在一定范围内，抗原剂量越大产生的免疫应答越强，免疫效 果也越好。一般为0.1～1.0mg/kg体重，但也因不同物质而异，剂量过小时，抗原进入体内 衰退很快，只引起少数细胞发生免疫应答，免疫反应弱；剂量过大易发生免疫耐受。本实验 结果显示制备抗哇巴因多克隆抗体的最适免疫剂量为1.75mg/次。
综上所述，抗哇巴因多克隆抗体的制备较佳免疫间隔为6周，较适免疫剂量为1.75mg/次， 而高效价、高特异性、高亲和力的特异性抗哇巴因多克隆抗体的制备成功，对于建立能检测 人体内源性哇巴因的免疫检测法-放射免疫测定法及酶联免疫吸附法打下了基础。
国家自然科学基金资助项目(No.3907407)
参考文献
1.Hamlyn JM,Blaustein MP,Bova S et al.Identification and char acterization of a ouabain-like compound from human plasma[J].Proc Natl Acad S ci USA， 1991;88∶6259
2.吕卓人，Boschi S,Borghi C等.人血浆部分纯化的内源性钠泵抑制物生物 学特性[J].上海第二医科大学学报，1992；12(1)∶42
3.Butler Jr VP,Tse-Eng D.Immunology of digoxin and other cardiac glycos ides[A].Methods Enzymol,1984;84∶560
4.Douglas W, Michale A,Jed F et al.Development of an immunoassay for endogenous digitalislike factor[J].Hypertension,1991;17∶936
5.Muller R. Calculation of average antibody affinity in antihapten sera from data obtained by competitive RIA[J].J Immunol Methods,1980;34∶345
6.林其燧，苏薇，宋耀虹等.地高辛抗体的制备和应用.中华医学检验杂志，1996 ；19(2)∶75
7.Goto A, Yamada K,Yagi N et al.Novel concepts on the roles of ouaba in -like compound in hypertension[J].J Hypertens, 1992;10(Suppl4)∶s50
8.丁国良，吕卓人，杨鼎颐等.高血压病人血浆内源性类哇巴因物质的部分纯化与 鉴定[J].中国病理生理杂志，1996；12(7)∶722
9.Douglas W, Michael A,Jed F et al.Development of an immunoassay fo r endogenous digitalislike factor[J].Hypertension,1991;17∶936
(1999-05-06收稿 1999-10-29修回)
作者：于汶 葛蘅 吕卓人 袁育康
单位：于汶 葛蘅 吕卓人(西安医科大学第一临床医学院心内科 西安 710061)；袁育康(西安医科大学免疫教研室)
关键词：哇巴因；抗体；免疫
西安医科大学学报000126摘要 制备抗哇巴因多克隆抗体，探讨最佳的免疫周期及 免疫剂量。应用哇巴因(ouabain)-牛血清白蛋白(BSA)结合物为抗原免疫家兔，每周从 兔 耳缘静脉采血，监测哇巴因特异抗体的产生；以0.25mg/次、1mg/次、1.75mg/次、2mg/次 四 种不同免疫剂量进行最佳免疫剂量的研究。5个月后颈动脉取血，进行抗体效价、亲和力及 特异性的检测。结果显示免疫间隔为6周、免疫剂量为1.75mg/次时可以获得高效价、高亲 和力和高特异性的哇巴因抗血清。
中图分类号 R392.11 文献标识码 B
文章编号 0258-0659(2000)01-00 66-03
Study on the production of polyclonal antiouabain antibody
Yu Wen,Ge Heng, Lü Zhuoren et al
(Dept.of Cardiovascular Internal Medi cine, First Affiliated Hospital,Xian Medical University， Xi′an 710061,China)
ABSTRACT This study described the preparation of polyclonal an ti-ouabain antibody.Rabbits were immunized with bovine serum albumin (BSA)-oua bain conjugates in 4 different doses of 0.25mg,1.0mg,1.75mg,and 2mg once immun iz ation.The effects of the period of immunization (2weeks, 4 weeks and 6 weeks)on the production of antibody were also had been studied.The t iter of antibody was measur ed once a week.The results have showed that the anti-ouabain antibody was of hi ght titer, high affinity and high specificity for ouabain when the dose of BSA- ouabain conjugates we used to immunize rabbits was 1.75mg and the period of immu nization was 6 weeks.
KEY WORDS ouabain antibody immunize
内源性哇巴因(Endogenous ouabain, EO)是新近发现的由肾上腺皮质球状带所分泌的一种新 的类固醇激素[1]，具有抑制对哇巴因敏感的钠泵活性的生物学特性，用高效液相 色谱分析及其他生化检测方法，无法同哇巴因相区别[2]。EO在正常人体内含量甚 微，用普通检验学方法难以检测出来。无灵敏、特异和标准的检测方法已成为EO研究中的重 要 障碍，成为深入研究EO的“瓶颈”问题。为此，本研究旨在制备抗哇巴因多克隆抗体，并探 讨免疫周期和剂量，以能获得高效价、高亲和力和高特异性的抗哇巴因多克隆抗体，这对建 立EO的免疫检测方法将具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 动物分组
1.1.1 免疫周期分组 14只雄性健康家兔， 年龄均为 4～5月，体重2～2.5kg，随机分为3组：①免疫间隔为2周，n=4;②免疫间隔为4周， n=4;③免疫间隔为6周，n=6。实验过程中3组的饲养、生活条件完全相同，免疫剂量 均为1mg/次。
1.1.2 免疫剂量分组 16只雄性健康家兔，年龄均为4 ～ 5月，体重2～2.5kg，随机分为4组：①免疫剂量为0.25mg/次，n=4；②免疫剂量为1 mg/次，n=4；③免疫剂量为1.75mg/次，n=4；④免疫剂量为2.5mg/ 次，n=5。实验过程中4组的饲养、生活条件完全相同，免疫间隔均为6周。
1.2 方法
1.2.1 哇巴因-BSA结合物的合成[3] 称取 哇巴 因溶于5ml蒸馏水中，滴加入2.5ml新配制的高碘酸钠，进行氧化反应。然后加入含2μmol 牛血清白蛋白(BSA)溶液中，室温下搅拌，加入硼氢化钠0.3g和等 体积的硫酸氨溶液，离心后取沉淀物溶于5ml 0.15mol的碳酸氢钠中，装入透析袋， 透析60h后分装。
1.2.2 哇巴因-BSA结合物的检测[3] Fo lin-酚法检测哇巴因-BSA结合物中蛋白质含量，并用高效液相色谱分析，计算哇巴 因与BSA的克分子结合率。
1.2.3 免疫程序及监测 初次免疫原为哇巴因-BSA与 等量的弗氏完全佐剂的混合物，首次剂量加倍，常规碘酒、酒精消毒颈背部皮肤后，皮下 10点注射；随后加强免疫的抗原为哇巴因-BSA与等量的弗氏不完全佐剂混合而成，按每 组的不同免疫间隔时间及免疫剂量给各组家兔进行加强免疫，每周从兔耳缘静脉取血1ml监 测抗哇巴因抗体产生情况。末次免疫后，当抗体效价达到一定程度不再增加或有下降趋势时 ，从颈动脉放血，无菌条件下分离血清，保存于-70℃低温冰箱内。
1.2.4 抗哇巴因抗体效价测定[4] 用酶联免 疫吸附法检测。用含10mg/L的哇巴因-卵清蛋白100μl/孔包被微滴板及封闭洗板后，加入 不同稀释倍数的抗体血清，37℃下静置1h；再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔血清1 00μl/孔，1h后加底物显色，测定效价。
1.2.5 抗体的亲和常数测定 参照Muller方法[5 ]测定。
式中IT为致哇巴因-HRP与包被抗体结合达50%抑制时哇巴因标准物的摩尔浓度，Tt为 此 时哇巴因-HRP中的哇巴因的摩尔浓度，b为无哇巴因抑制物时结合于抗体上的哇巴因-H PR与总哇巴因-HPR浓度之比。
1.2.6 抗体的特异性测定[6] 测定具有同哇 巴 因结构相类似的几种环戊烷多氢菲结构的类固醇或药物与抗哇巴因多克隆抗体的交叉反应， 其反应率为X/Y，以%表示。X：导致抗哇巴因抗体同包被的哇巴因抗原产生50%抑制的哇巴因 摩尔浓度；Y：导致同样现象的相应药物的小分子摩尔浓度。其中，哇巴因为半抗原。
2 结 果
2.1 抗血清效价 2周、4周、6周三组抗哇巴因抗血清平均效价 分别为1∶5×104、1∶2×105、1∶5×105。免疫剂量为0.25mg、1.0mg、1.75mg、 2.5mg 4个剂量组家兔得到的抗哇巴因抗血清平均效价分别为1∶1×105、1∶2×105、 1∶5×105、1∶2×105。
2.2 抗体的特异性 与地高辛交叉反应率为5.4%，与肾 素、去甲肾上腺素、安体舒通、可的松、强的松、孕酮及甲基睾丸酮等临床常用的小分子药 物与三组哇巴因抗血清的交叉反应，均小于0.01%。
2.3 抗血清的亲和常数 2周、4周、6周3组抗血清的平 均亲和常数分别为(2.4±0.4)×109、(4.8±0.3)×109、(4.7±0.5)×109；0 .25mg、1.0mg、1.75mg、2.5mg 4个剂量组抗血清的平均亲和常数分别为(5.02±0.2)×1 09、(4.85±0.5)×109、(4.39±0.8)×109、(3.12±0.4)×109。
2.4 不同免疫周期对特异性哇巴因抗体产生的影响 2周 组家兔在接受免疫10周后，即第5次免疫后抗体不再上升，28周后抗体效价为1∶5×10 4。4周组家兔每次免疫时期均为抗体上升阶段，28周后抗体效价为1∶2×105，但仍 呈上升趋势。6周组在免疫后5～6周时抗体效价不再上升，此后加强免疫，抗体水平迅速 升 高，28周后抗体效价达1∶5×105，其抗血清具有高特异性及高亲和力，提示免疫间隔 为6周较宜。
2.5 不同免疫剂量对抗体产生的影响 应用于免疫动物 的抗原量，在一定范围内抗原剂量越大产生的免疫应答越强，免疫效果也越好。本实验结果 显示制备抗哇巴因多克隆抗体的最适免疫剂量为1.75mg/次。
3 讨 论
内源性哇巴因(EO)是肾上腺皮质所分泌的一种新的类固醇激素[1]，具有重 要的生理和病理意义。大量的证据表明，EO是高血压发病的重要因素之一，参与了高血压的 形成[7]。过去人们对EO的检测方法主要可分为两类：一类是生物学活性测定法 [8]，如测定其与3H-哇巴因竞争性地同钠泵结合率，抑制钠泵活性的 程度 及对红细胞摄取86Rb的抑制率，但由于存在放射性污染、检测操作复杂，且所需试 剂价格昂贵，难于在临床推广普及。另一类是免疫学活性测定，如地高辛放免法[9 ] ，利用地高辛与哇巴因的交叉免疫反应进行检测。但因体内哇巴因含量低，市场上的地高 辛免疫测定试剂盒无法准确检测，更因为地高辛与哇巴因的分子结构不同 ，应用地高辛抗体检测哇巴因特异性差，所得结果不可靠而逐渐被淘汰。因此，制备抗哇巴 因多克隆抗体，建立特异性高且易于推广的检测方法无疑是该领域研究的关键问题之一。
多克隆抗体制备的影响因素主要为：免疫原性及其分子量、免疫对象、免疫原的剂量、免疫 途径和免疫周期。为获得高效价、高亲和力和高特异性的抗哇巴因多克隆抗体，本实验制备 了BSA与哇巴因的结合物为免疫原，采用颈、背部皮下多点注射，免疫家兔，并分组探讨研 究最适免疫周期和剂量。
因家兔对抗原的反应性好，容易产生高亲和力的抗体，且价格便宜，大小适中，故本实验的 免疫对象采用年龄为4～5月，体重2～2.5kg的健康家兔。哇巴因是一种小分子多肽，单 独不能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，需与蛋白结合成为完全抗原，本实验以牛血清白 蛋 白(BSA)作为载体，制备BSA与哇巴因的结合物免疫家兔。抗体产生的一般规律是初次反应、 再次反应和回忆反应的动态过程。动物经过第一次特定免疫后，经一定潜伏期(细胞增殖、 分化)才在血液中出现抗体。先是IgM，随后出现IgG，初次反应所产生的抗体量一般不多， 效价较低，持续时间也较短。当第二次相同抗原注射后，由于抗体的一部分与再次注入的抗 原结合所致原有抗体量的降低，随后IgG型抗体迅速大量增加，可比初次反应产生的量多几 倍到几十倍。由抗原刺激而产生抗体经过一定时间后可以逐渐消失，此时若再次接触抗原可 使已消失的抗体迅速上升(回忆反应)，由此而产生的抗体特异性好、效价高。
免疫动物的程序一般为第一次加强免疫与初次免疫间隔2～4周左右，而且此后每次加强免 疫的间隔也同样为2～4周左右，故本实验分别选择2周、4周、6周 3组不同免疫周期进行免 疫 ，以寻求较佳免疫时机。从抗哇巴因特异性抗体产生的免疫应答模式可以看出，2周组家 兔在接受免疫10周后，即第5次免疫后抗体不再上升，28周后抗体效价为1∶5×104， 可能是由于免疫间隔太短，大剂量的抗原注入动物体内，产生了特异性的无应答状态， 即免疫耐受；4周组家兔每次免疫时期均为抗体上升阶段，28周后抗体效价为1∶2×105 ， 但仍呈上升趋势。而从免疫间隔为6周组的免疫应答模式可以看出，在免疫后5～6周时抗体 效价不再上升，此后加强免疫，抗体水平的升高更为迅速，28周后查抗体效价达1∶5×10 5，其抗血清具有高特异性及高亲和力，提示较佳免疫间隔为6周。
至于应用于免疫动物的抗原量，在一定范围内，抗原剂量越大产生的免疫应答越强，免疫效 果也越好。一般为0.1～1.0mg/kg体重，但也因不同物质而异，剂量过小时，抗原进入体内 衰退很快，只引起少数细胞发生免疫应答，免疫反应弱；剂量过大易发生免疫耐受。本实验 结果显示制备抗哇巴因多克隆抗体的最适免疫剂量为1.75mg/次。
综上所述，抗哇巴因多克隆抗体的制备较佳免疫间隔为6周，较适免疫剂量为1.75mg/次， 而高效价、高特异性、高亲和力的特异性抗哇巴因多克隆抗体的制备成功，对于建立能检测 人体内源性哇巴因的免疫检测法-放射免疫测定法及酶联免疫吸附法打下了基础。
国家自然科学基金资助项目(No.3907407)
参考文献
1.Hamlyn JM,Blaustein MP,Bova S et al.Identification and char acterization of a ouabain-like compound from human plasma[J].Proc Natl Acad S ci USA， 1991;88∶6259
2.吕卓人，Boschi S,Borghi C等.人血浆部分纯化的内源性钠泵抑制物生物 学特性[J].上海第二医科大学学报，1992；12(1)∶42
3.Butler Jr VP,Tse-Eng D.Immunology of digoxin and other cardiac glycos ides[A].Methods Enzymol,1984;84∶560
4.Douglas W, Michale A,Jed F et al.Development of an immunoassay for endogenous digitalislike factor[J].Hypertension,1991;17∶936
5.Muller R. Calculation of average antibody affinity in antihapten sera from data obtained by competitive RIA[J].J Immunol Methods,1980;34∶345
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(1999-05-06收稿 1999-10-29修回)
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