PRK术后家兔角膜透射电镜、扫描电镜的实验研究
http://www.100md.com
张华. 胡海涛. 任惠民. 刘勇. 孙乃学!. 郭绒霞!
准分子激光角膜切削术(PRK).角膜(兔).伤口愈合.超微结构.
参见附件(196kb)。
作者：张华 胡海涛 任惠民 刘勇 孙乃学 郭绒霞
单位：(西安医科大学基础医学院解剖学教研室 西安 710061)
关键词：准分子激光角膜切削术(PRK)；角膜(兔)；伤口愈合；超微结构
西安医科大学学报000217 摘要 应用SVS APEX PLUS型准分子激光治疗系统对6只家兔双眼进行PRK术，设定右眼-4.00D，左眼-8.00D。分别于术后3天、30天、100天两组随机选取1只家兔，使其猝死摘除双眼球，取其角膜。每只角膜分为两半，一半角膜电镜下观察其超微结构(1/4行SEM，1/4行TEM)。透射电镜观察手术后100天，角膜上皮细胞基本恢复正常。扫描电镜观察则上皮细胞界限分明，上皮明亮细胞较多，但微绒毛、微皱褶相对减少。提示PRK术后100天角膜组织结构基本正常，但仍有组织薄弱处和特殊性改变。其角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少，可能是临床上PRK术后部分患者近期角膜干燥的原因之一。
中图分类号 R779.63 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0134-03
The study of TEM and SEM in the rabbit cornea after excimer laser photorefractive keratectomy
Zhang Hua Hu Haitao Ren Huimin
(Basic Medical College,Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT To evaluate the corneal healing of non-equality diopter response ultrastructural after excimer laser photorefractive keratectomy (PRK) with SVS APEX PLUS excimer laser, PRK was operated on both eyes of 6 white rabbits (12 eyes).PRK was peformed on right eye of the rabbit for an attampted correction of -4.00 diopter,a nd performed on left eye of the rabbit for an attempted correction of -8.00 diopter.In 10d,30d and 100d the eyes were re-examined repectively.The eyes of one rabbit were enucleated at random.Half of each cornea was prepared for transmission electron microscope(TEM) and scanning electron microscope(SEM) studing.TEM demonst ration in 100 d after PRK,the corneal epithelium returned to normal again.SEM demonstration in 100d after PRK,cornedepithelium was clear with more bright epithlium.Microplicae and mcrovilli were less than before.We found that despite recovery of acontinuous and smooth epithelial layer and near normal corneal tissues 100 d after PRK,abnormalities of both epithelium and superficial stroma could be detected in the area of ablation.The microplicae and microvilli of rabbit cornea epithelium became less after PRK,which could be one of reasons which cause ocular dry sensation in the same patients.
KEY WORDS excimer laser photorefractive keratectomy(PRK) cornea(rabbit) wound healing ultrastructural
准分子激光角膜切削术(Excimer laser photorefractive keratectomy, PRK)的问世，开创了角膜屈光手术的新时代。PRK是在去除角膜上皮后，用准分子激光对角膜中央的前弹力层和前基层质进行切削，使角膜中央的前表面相对变平，从而达到矫正近视的目的[1～3]。由于它与传统的角膜屈光手术在原理和手术方法上都有许多不同之处[4～5]，因此，有必要对PRK术后创面愈合过程及其控制作进一步的研究。本文利用电镜技术，研究家兔不同屈光度PRK术后角膜愈合过程中的超微结构改变。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康白色家兔6只，体重2.0～2.5kg，第四军医大学实验动物饲养中心提供，雌雄兼用。
1.2 主要仪器 准分子激光系统SVS APEX PLUS型(美国森美公司)。H-600透射式电子显微镜(日本)。KyKy-2000扫描电子显微镜(中国科学院科学仪器厂)。
1.3 手术方法 采用SVS APEX PLUS型准分子激光治疗系统对6只家兔双眼进行PRK术，设定右眼-4.00D，左眼-8.00D。按设定的屈光度切削，-4.00D采用单中心一次性切削，-8.00D采用多区切削(Stepped multizone PRK)，手术方法参照Zhang等[3]。术后3d、30d和100d进行复查，内容包括：角膜上皮的再生、角膜haze。并同时分别于两组随机各选取1只家兔，使其猝死摘除双眼球，取其角膜。每只角膜分为两半，一半角膜电镜(透射电镜和扫描电镜)下观察其超微结构(1/4行SEM，1/4行TEM)。
1.4 电镜标本制作 2.5戊二醛前固定2h(4℃)后，1%四氧化锇后固定1h，乙醇系统脱水，Epon812包埋，超薄切片机切片约50nm，铅、铀染色，透射电镜观察拍照。扫描电镜样品经2.5%戊二醛固定，在液氮内垂直断裂，1%四氧化锇后固定，乙醇系统脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后用扫描电镜观察拍照。
1.5 角膜haze临床分级 参照Snibson等[6]制定的标准。
2 结 果
2.1 裂隙灯观察 所有家兔角膜上皮均在PRK术后3d愈合，术后15d开始出现不同程度的角膜haze,30～60d时最明显，术后100d，除1只家兔角膜haze为1级外，余家兔角膜haze为0级。
2.2 透射电镜观察 术后3天，角膜上皮细胞1层或2层覆盖切削区，角膜前基质胶原纤维排列紊乱，深层基质胶原纤维排列较整齐，后弹力层和内皮细胞结构未见明显改变。术后30d，可见角膜上皮细胞增生，体积增大，细胞由正常的5层或6层增加到7层或8层；上皮细胞间可见桥粒连接，基底膜形成，但有不连续现象；上皮基底细胞于基底膜之间可见半桥粒。术后100d，角膜上皮细胞基本恢复正常。角膜前基质、深层基质胶原纤维排列已基本整齐，基底膜已基本连续(见图1，图2)。
2.3 扫描电镜观察 PRK术后3天，切削区家兔角膜上皮肿胀，上皮细胞界限不明，切削区边沿形成堤坝样外观。术后30d，切削区边沿堤坝样外观消失，上皮细胞界限已分明，微绒毛、微皱褶相对减少。术后100d，上皮细胞界限分明，上皮明亮细胞较多，但微绒毛、微皱褶相对减少。
图1 PRK术后30天。TEM显示，兔角膜前基质排列紊乱的胶原纤维，深层基质排列整剂的胶原纤维， ×25000
图2 PRK术后100天。TEM显示，兔角膜前基质排列整剂的胶原纤维，基底膜形成，有不连续现象 ×5000
3 讨 论
3.1 正常角膜上皮层、前弹力层和基质层的组织学、超微结构
上皮细胞为复层上皮，细胞又分为三种：基底细胞、翼状细胞、表层细胞。基底细胞底部的细胞膜厚约8nm，其对侧有一层基底膜。沿底部细胞膜有许多半桥粒。电镜下显示基底膜为完整的嗜锇酸层，相邻的基底膜细胞其侧壁细胞膜以桥粒及粘连斑相连接。前弹力层又名Bowman氏膜，用电镜观察显示该膜主要由胶原纤维所组成，前弹力层的前面是光滑的，与角膜上皮的基底膜相毗邻，厚约8～14μm。角膜基质层有胶原纤维所构成，厚约500μm，在电镜下，胶原纤维相互平行，大小一致，间隔相等。
3.2 PRK术后角膜上皮的超微结构改变
PRK术后可见切削区上皮缺损。术后3天，上皮基本愈合，此时上皮细胞仅1～2层，细胞体积较正常细胞体积大，形状扁平。术后1周至1个月，上皮增加到4～10层，厚度约45～70μm，细胞体积仍较正常大。Bowman氏膜缺损，在上皮与基质之间可见基底膜和半桥粒[7]。术后3个月时，上皮过度增生最为明显，由11～12层细胞组成，厚度达70～80μm[8]，上皮层增厚由细胞层数增多及细胞体积增大两方面原因所致[9]，角膜基底细胞与其下基质附着不甚紧密，并有空泡形成，可见半桥粒、锚状细丝和锚状斑[7，8]。至13～15个月时，角膜上皮基本恢复正常，由5～8层细胞组成，厚度约30μm[7]，但电镜观察显示其超微结构仍未恢复正常，基底细胞内可见空泡，基膜不完整，可见半桥粒、锚状细丝和锚状斑[8，10]，而这些都是PRK术后上皮与基质连接的重要结构，表明PRK术后角膜上皮的过度增殖在术后3个月时达到高峰，持续时间长达6～12个月，而某些超微结构的异常可持续1年以上。
3.3 PRK术后角膜前基质的超微结构改变
PRK术后角膜前基质成纤维细胞活化增殖，并产生胶原等细胞外基质，形成至少10～30μm的新生瘢痕组织。这些组织的病理学改变在术后3个月时表现最为明显，持续时间长达9～13个月，甚至18个月[10]，表明PRK术后角膜混浊及屈光回退的发生与前基质成纤维细胞的活化增、空泡形成、胶原全成及胶原排列紊乱有关[8]。后期角膜前基质成纤维细胞数量恢复正常，瘢痕组织重塑，从而角膜变为透明，厚度稳定。
3.4 PRK术后角膜后基质、后弹力层及内皮细胞的超微结构改变
本实验结果表明，角膜后基质、后弹力层和内皮细胞结构未见明显改变。
3.5 扫描电镜观察结果
PRK术后3天，切削区家兔角膜上皮肿胀，上皮细胞界线不明，堤坝样外观。术后30d，切削区边沿形成堤坝样外观消失，上皮细胞界线已分明，微绒毛、微皱褶相对减少。术后100d，上皮细胞界线分明，上皮明亮细胞较多，但微绒毛，微皱褶相对减少。业已证明，微绒毛微皱褶是表面上皮细胞正常结构的一部分，对角膜前泪膜的滞留起着重要作用。PRK术后家兔角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少，可能是临床上PRK术后部分患者角膜干燥的原因之一。
3.6 临床意义
尽管兔眼和人眼的结构不尽相同，但角膜结构却相似或相近，通过对兔眼PRK的实验研究，可对PRK在临床应用方面提供理依据的参考。本实验结果可能有以下临床意义：①兔眼PRK术后100d显示，角膜组织结构基本正常，可支持PRK临床应用中的安全性[1，3]。②PRK术后家兔角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少，可能是临床上PRK术后部分患者近期角膜干燥的原因之一。
参考文献
1，张华，郭绒霞，孙乃学等.准分子激光角膜切削术治疗近视和近视散光的临床研究[J].济宁医学院学报，1998；21(4)∶5
2，张 华，宋宏文，郭绒霞等.准分子激光屈光性角膜切削术的并发症及处理方法[J].西安医科大学学报，1999；20(1)∶133
3，Zhang Hua,Guo Rongxia,Sun Naixue et al.Clinical analysis of excimer laser photorefractive Keratectomy for myopia and myopic astigmation[J].J Xi'an Med Unive(Eng1.Ed),1999;11(1)∶52
4，Vajpayee RB,McCarty CA, Taylor HR et al.Overcorrectionafter excimer later treatmetn of myopia and myopic astigmatism[J].Arch Ophthalmol,1996;114(2)∶252
5，O'Brart DPS,Corbett MC, Lohmann CP et al.The effects of ablation diameter on the outcome of excimer laser photorefractive keratectomy:a prospective,randomized, double-blind study[J].Arch Ophthalmol,1995;113(4)∶438
6，Snibson DR,Carson CA, Aldred GF et al.One-year evaluation of excimer laser photorefractive keratectomy for myopia and myopic astigmatism[J].Arch Ophthalmol,1995;113(8)∶994
7，Fantes FE, Hanna KD.Waring GO et al.Wound healing after excimer laser ker atomileusis (photorefractive keratectomy)in monkeys[J].Arch Ophthalmol,1990;108(5)∶665
8，Hanna KD,Pouliquen YM,Waring GO et al.Corneal wound healing after in monkey repeated excimer laser photorefractive keratectomy[J].Arch Ophthalmol, 1992;110(10)∶1286
9，Shieh E,Moreira H, D'Arcy J et al.Quantitative analysis of wound healing after cylindrical and spherical excimer laser ablations[J].Ophthalmology,1992;99(8)∶1050
10，Fountain TR,Cruz Z, Green R,Reassembly of corneal epithelial adhesion structures after excimer laser keratectomy in humans[J].Arch Ophthalmol,1994;112(7)∶967
(1999-08-26收稿 1999-09-14修回)
作者：张华 胡海涛 任惠民 刘勇 孙乃学 郭绒霞
单位：(西安医科大学基础医学院解剖学教研室 西安 710061)
关键词：准分子激光角膜切削术(PRK)；角膜(兔)；伤口愈合；超微结构
西安医科大学学报000217 摘要 应用SVS APEX PLUS型准分子激光治疗系统对6只家兔双眼进行PRK术，设定右眼-4.00D，左眼-8.00D。分别于术后3天、30天、100天两组随机选取1只家兔，使其猝死摘除双眼球，取其角膜。每只角膜分为两半，一半角膜电镜下观察其超微结构(1/4行SEM，1/4行TEM)。透射电镜观察手术后100天，角膜上皮细胞基本恢复正常。扫描电镜观察则上皮细胞界限分明，上皮明亮细胞较多，但微绒毛、微皱褶相对减少。提示PRK术后100天角膜组织结构基本正常，但仍有组织薄弱处和特殊性改变。其角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少，可能是临床上PRK术后部分患者近期角膜干燥的原因之一。
中图分类号 R779.63 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0134-03
The study of TEM and SEM in the rabbit cornea after excimer laser photorefractive keratectomy
Zhang Hua Hu Haitao Ren Huimin
(Basic Medical College,Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT To evaluate the corneal healing of non-equality diopter response ultrastructural after excimer laser photorefractive keratectomy (PRK) with SVS APEX PLUS excimer laser, PRK was operated on both eyes of 6 white rabbits (12 eyes).PRK was peformed on right eye of the rabbit for an attampted correction of -4.00 diopter,a nd performed on left eye of the rabbit for an attempted correction of -8.00 diopter.In 10d,30d and 100d the eyes were re-examined repectively.The eyes of one rabbit were enucleated at random.Half of each cornea was prepared for transmission electron microscope(TEM) and scanning electron microscope(SEM) studing.TEM demonst ration in 100 d after PRK,the corneal epithelium returned to normal again.SEM demonstration in 100d after PRK,cornedepithelium was clear with more bright epithlium.Microplicae and mcrovilli were less than before.We found that despite recovery of acontinuous and smooth epithelial layer and near normal corneal tissues 100 d after PRK,abnormalities of both epithelium and superficial stroma could be detected in the area of ablation.The microplicae and microvilli of rabbit cornea epithelium became less after PRK,which could be one of reasons which cause ocular dry sensation in the same patients.
KEY WORDS excimer laser photorefractive keratectomy(PRK) cornea(rabbit) wound healing ultrastructural
准分子激光角膜切削术(Excimer laser photorefractive keratectomy, PRK)的问世，开创了角膜屈光手术的新时代。PRK是在去除角膜上皮后，用准分子激光对角膜中央的前弹力层和前基层质进行切削，使角膜中央的前表面相对变平，从而达到矫正近视的目的[1～3]。由于它与传统的角膜屈光手术在原理和手术方法上都有许多不同之处[4～5]，因此，有必要对PRK术后创面愈合过程及其控制作进一步的研究。本文利用电镜技术，研究家兔不同屈光度PRK术后角膜愈合过程中的超微结构改变。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康白色家兔6只，体重2.0～2.5kg，第四军医大学实验动物饲养中心提供，雌雄兼用。
1.2 主要仪器 准分子激光系统SVS APEX PLUS型(美国森美公司)。H-600透射式电子显微镜(日本)。KyKy-2000扫描电子显微镜(中国科学院科学仪器厂)。
1.3 手术方法 采用SVS APEX PLUS型准分子激光治疗系统对6只家兔双眼进行PRK术，设定右眼-4.00D，左眼-8.00D。按设定的屈光度切削，-4.00D采用单中心一次性切削，-8.00D采用多区切削(Stepped multizone PRK)，手术方法参照Zhang等[3]。术后3d、30d和100d进行复查，内容包括：角膜上皮的再生、角膜haze。并同时分别于两组随机各选取1只家兔，使其猝死摘除双眼球，取其角膜。每只角膜分为两半，一半角膜电镜(透射电镜和扫描电镜)下观察其超微结构(1/4行SEM，1/4行TEM)。
1.4 电镜标本制作 2.5戊二醛前固定2h(4℃)后，1%四氧化锇后固定1h，乙醇系统脱水，Epon812包埋，超薄切片机切片约50nm，铅、铀染色，透射电镜观察拍照。扫描电镜样品经2.5%戊二醛固定，在液氮内垂直断裂，1%四氧化锇后固定，乙醇系统脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后用扫描电镜观察拍照。
1.5 角膜haze临床分级 参照Snibson等[6]制定的标准。
2 结 果
2.1 裂隙灯观察 所有家兔角膜上皮均在PRK术后3d愈合，术后15d开始出现不同程度的角膜haze,30～60d时最明显，术后100d，除1只家兔角膜haze为1级外，余家兔角膜haze为0级。
2.2 透射电镜观察 术后3天，角膜上皮细胞1层或2层覆盖切削区，角膜前基质胶原纤维排列紊乱，深层基质胶原纤维排列较整齐，后弹力层和内皮细胞结构未见明显改变。术后30d，可见角膜上皮细胞增生，体积增大，细胞由正常的5层或6层增加到7层或8层；上皮细胞间可见桥粒连接，基底膜形成，但有不连续现象；上皮基底细胞于基底膜之间可见半桥粒。术后100d，角膜上皮细胞基本恢复正常。角膜前基质、深层基质胶原纤维排列已基本整齐，基底膜已基本连续(见图1，图2)。
2.3 扫描电镜观察 PRK术后3天，切削区家兔角膜上皮肿胀，上皮细胞界限不明，切削区边沿形成堤坝样外观。术后30d，切削区边沿堤坝样外观消失，上皮细胞界限已分明，微绒毛、微皱褶相对减少。术后100d，上皮细胞界限分明，上皮明亮细胞较多，但微绒毛、微皱褶相对减少。
图1 PRK术后30天。TEM显示，兔角膜前基质排列紊乱的胶原纤维，深层基质排列整剂的胶原纤维， ×25000
图2 PRK术后100天。TEM显示，兔角膜前基质排列整剂的胶原纤维，基底膜形成，有不连续现象 ×5000
3 讨 论
3.1 正常角膜上皮层、前弹力层和基质层的组织学、超微结构
上皮细胞为复层上皮，细胞又分为三种：基底细胞、翼状细胞、表层细胞。基底细胞底部的细胞膜厚约8nm，其对侧有一层基底膜。沿底部细胞膜有许多半桥粒。电镜下显示基底膜为完整的嗜锇酸层，相邻的基底膜细胞其侧壁细胞膜以桥粒及粘连斑相连接。前弹力层又名Bowman氏膜，用电镜观察显示该膜主要由胶原纤维所组成，前弹力层的前面是光滑的，与角膜上皮的基底膜相毗邻，厚约8～14μm。角膜基质层有胶原纤维所构成，厚约500μm，在电镜下，胶原纤维相互平行，大小一致，间隔相等。
3.2 PRK术后角膜上皮的超微结构改变
PRK术后可见切削区上皮缺损。术后3天，上皮基本愈合，此时上皮细胞仅1～2层，细胞体积较正常细胞体积大，形状扁平。术后1周至1个月，上皮增加到4～10层，厚度约45～70μm，细胞体积仍较正常大。Bowman氏膜缺损，在上皮与基质之间可见基底膜和半桥粒[7]。术后3个月时，上皮过度增生最为明显，由11～12层细胞组成，厚度达70～80μm[8]，上皮层增厚由细胞层数增多及细胞体积增大两方面原因所致[9]，角膜基底细胞与其下基质附着不甚紧密，并有空泡形成，可见半桥粒、锚状细丝和锚状斑[7，8]。至13～15个月时，角膜上皮基本恢复正常，由5～8层细胞组成，厚度约30μm[7]，但电镜观察显示其超微结构仍未恢复正常，基底细胞内可见空泡，基膜不完整，可见半桥粒、锚状细丝和锚状斑[8，10]，而这些都是PRK术后上皮与基质连接的重要结构，表明PRK术后角膜上皮的过度增殖在术后3个月时达到高峰，持续时间长达6～12个月，而某些超微结构的异常可持续1年以上。
3.3 PRK术后角膜前基质的超微结构改变
PRK术后角膜前基质成纤维细胞活化增殖，并产生胶原等细胞外基质，形成至少10～30μm的新生瘢痕组织。这些组织的病理学改变在术后3个月时表现最为明显，持续时间长达9～13个月，甚至18个月[10]，表明PRK术后角膜混浊及屈光回退的发生与前基质成纤维细胞的活化增、空泡形成、胶原全成及胶原排列紊乱有关[8]。后期角膜前基质成纤维细胞数量恢复正常，瘢痕组织重塑，从而角膜变为透明，厚度稳定。
3.4 PRK术后角膜后基质、后弹力层及内皮细胞的超微结构改变
本实验结果表明，角膜后基质、后弹力层和内皮细胞结构未见明显改变。
3.5 扫描电镜观察结果
PRK术后3天，切削区家兔角膜上皮肿胀，上皮细胞界线不明，堤坝样外观。术后30d，切削区边沿形成堤坝样外观消失，上皮细胞界线已分明，微绒毛、微皱褶相对减少。术后100d，上皮细胞界线分明，上皮明亮细胞较多，但微绒毛，微皱褶相对减少。业已证明，微绒毛微皱褶是表面上皮细胞正常结构的一部分，对角膜前泪膜的滞留起着重要作用。PRK术后家兔角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少，可能是临床上PRK术后部分患者角膜干燥的原因之一。
3.6 临床意义
尽管兔眼和人眼的结构不尽相同，但角膜结构却相似或相近，通过对兔眼PRK的实验研究，可对PRK在临床应用方面提供理依据的参考。本实验结果可能有以下临床意义：①兔眼PRK术后100d显示，角膜组织结构基本正常，可支持PRK临床应用中的安全性[1，3]。②PRK术后家兔角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少，可能是临床上PRK术后部分患者近期角膜干燥的原因之一。
参考文献
1，张华，郭绒霞，孙乃学等.准分子激光角膜切削术治疗近视和近视散光的临床研究[J].济宁医学院学报，1998；21(4)∶5
2，张 华，宋宏文，郭绒霞等.准分子激光屈光性角膜切削术的并发症及处理方法[J].西安医科大学学报，1999；20(1)∶133
3，Zhang Hua,Guo Rongxia,Sun Naixue et al.Clinical analysis of excimer laser photorefractive Keratectomy for myopia and myopic astigmation[J].J Xi'an Med Unive(Eng1.Ed),1999;11(1)∶52
4，Vajpayee RB,McCarty CA, Taylor HR et al.Overcorrectionafter excimer later treatmetn of myopia and myopic astigmatism[J].Arch Ophthalmol,1996;114(2)∶252
5，O'Brart DPS,Corbett MC, Lohmann CP et al.The effects of ablation diameter on the outcome of excimer laser photorefractive keratectomy:a prospective,randomized, double-blind study[J].Arch Ophthalmol,1995;113(4)∶438
6，Snibson DR,Carson CA, Aldred GF et al.One-year evaluation of excimer laser photorefractive keratectomy for myopia and myopic astigmatism[J].Arch Ophthalmol,1995;113(8)∶994
7，Fantes FE, Hanna KD.Waring GO et al.Wound healing after excimer laser ker atomileusis (photorefractive keratectomy)in monkeys[J].Arch Ophthalmol,1990;108(5)∶665
8，Hanna KD,Pouliquen YM,Waring GO et al.Corneal wound healing after in monkey repeated excimer laser photorefractive keratectomy[J].Arch Ophthalmol, 1992;110(10)∶1286
9，Shieh E,Moreira H, D'Arcy J et al.Quantitative analysis of wound healing after cylindrical and spherical excimer laser ablations[J].Ophthalmology,1992;99(8)∶1050
10，Fountain TR,Cruz Z, Green R,Reassembly of corneal epithelial adhesion structures after excimer laser keratectomy in humans[J].Arch Ophthalmol,1994;112(7)∶967
(1999-08-26收稿 1999-09-14修回)
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